發(fā)布時間：2017-12-15 07:26

  本文關(guān)鍵詞：T3對鈣磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響及其分子機制

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【摘要】：目的本文擬通過鈣化模型在細胞水平研究三碘甲腺原氨酸(3,5,3'-Triiodothyronine,T3)在血管鈣化及血管平滑肌細胞(VSMCs)向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化時相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的變化和作用,并進一步明確T3調(diào)節(jié)血管鈣化及VSMCs向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化的主要信導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而論證T3是抑制血管鈣化的重要內(nèi)源性保護物質(zhì),為臨床調(diào)節(jié)和逆轉(zhuǎn)血管鈣化所致的動脈高壓相關(guān)疾病提供有效的實驗基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細胞A7r5,將細胞隨機分為正常對照組、鈣化模型組(加入β-甘油磷酸鹽和氯化鈣培養(yǎng)基)、T3干預(yù)組(在鈣磷培養(yǎng)基中加入T3,根據(jù)濃度再分為10-7、10-8、10-9mol/L三個亞組)和抑制劑干預(yù)組,對細胞采用茜素紅染色檢測鈣化結(jié)節(jié),細胞骨鈣素含量測定,ALP活性檢測,RT-PCR檢測 Runx2 和 Osterix 的 mRNA 含量,Western blot 檢測骨化指標 OPN、SM22 α-actin 和 SM1-actin 及信號通路調(diào)節(jié)蛋白 ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt 的表達水平,加入信號通路抑制劑后再次檢測Runx2和Osterix的mRNA含量以及OPN、SM22α-actin 和 SMα-actin 的蛋白含量。結(jié)果與正常對照組相比,鈣化組A7r5細胞的骨鈣素含量、ALP活性、Osterix和Runx2 mRNA水平、OPN蛋白水平均顯著升高(P0.01),SMα和SM22α蛋白水平顯著下降(P0.01);加入T3干預(yù)后細胞骨鈣素含量、ALP活性明顯降低,Osterix和Runx2 mRNA、OPN蛋白表達明顯下調(diào),而加入MMI后可阻斷以上T3的抑制效果;與鈣化組相比,抑制劑組Osterix和Runx2 mRNA、OPN蛋白表達顯著升高(P0.01)。鈣化組可檢測到信號通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表達增加,加入整合素αvβ3/ERK阻斷劑(PD98059)、PI3K/Akt拮抗劑(LY294002)后,再用T3進行干預(yù),抑制鈣化的效果依然存在,但與單純加抑制劑組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,兩組間比較提示LY294002的抑制效果較PD98059明顯(P0.01)。結(jié)論1、鈣磷培養(yǎng)液誘導(dǎo)A7r5細胞12天可成功構(gòu)建鈣化細胞模型。2、T3可降低A7r5鈣化細胞的鈣沉積及堿性磷酸酶活性,此效應(yīng)呈濃度依賴性,說明T3是調(diào)節(jié)血管鈣化的內(nèi)源性保護物質(zhì)。3、T3上調(diào)平滑肌細胞標志分子SM22 α和SMα,使骨相關(guān)蛋白OPN的表達增加,同時檢測到骨分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的mRNA水平下降,而加入T3拮抗劑MMI后,上述T3抑制鈣化的效果被部分拮抗,說明T3通過抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)來調(diào)節(jié)血管鈣化。4、鈣磷誘導(dǎo)A7r5細胞鈣化過程中可檢測到信號通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、Akt的活化,加入相應(yīng)的抑制劑后表型轉(zhuǎn)化特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix和Runx2 mRNA的表達均有所下調(diào),隨著抑制劑濃度的升高骨分化蛋白OPN的蛋白水平逐漸下降,收縮表型標志物SMα和SM22α的蛋白水平逐漸恢復(fù),利用篩選出的抑制劑濃度加入鈣化液后再用T3進行干預(yù),結(jié)果表明LY294002的抑制效果較PD98059明顯,提示鈣磷誘導(dǎo)的A7r5細胞鈣化可能與PI3K/Akt信號通路的激活有更明顯的關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1291107