本文關(guān)鍵詞：CTCF轉(zhuǎn)錄抑制miR-34a-5p及其在膀胱癌中的抑癌作用和分子機(jī)制研究

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【摘要】：背景:膀胱癌是我國泌尿系腫瘤中發(fā)病率最高的一種,其死亡率也是泌尿系腫瘤中的首位,全國范圍內(nèi),男性膀胱癌發(fā)病率居于所有男性惡性腫瘤第七位,女性膀胱癌的發(fā)病率則居于十五位以后。膀胱癌是源于尿路移行上皮細(xì)胞的癌癥,大約三分之一的膀胱癌在診斷時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。膀胱癌生物學(xué)行為復(fù)雜,易復(fù)發(fā)易轉(zhuǎn)移,5年生存率只有62%,但是根治性膀胱癌切除仍然是治療膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)。如何通過分子機(jī)制的研究尋找診斷或治療膀胱癌的新標(biāo)志和新靶點(diǎn),仍是目前膀胱癌研究的熱點(diǎn)問題。microRNA(miRNA)是一種長度約為19～22nt的內(nèi)源性非編碼RNA,其主要作用就是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)量。許多microRNA的表達(dá)量在不同的組織器官中,乃至不同的生理病理過程中都有特異性的表達(dá)差異。而在腫瘤中microRNA的特征性表達(dá)譜正是由于腫瘤中調(diào)控microRNA表達(dá)的相關(guān)因素發(fā)生了變化。作為經(jīng)典的抑癌microRNA,miR-34a-5p在膀胱癌中的抑癌作用也已被證實(shí),而其在膀胱癌中表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。目的驗(yàn)證miR-34a-5p在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)量,通過DNA甲基化的檢測(cè)和尋找在膀胱癌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-34a-5p的因子,探討膀胱癌中的miR-34a-5p的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。并采用功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34a-5p及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在膀胱癌細(xì)胞系中的生物學(xué)功能,明確其作用靶點(diǎn)及其對(duì)膀胱癌患者生存的影響。方法1)通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析膀胱癌細(xì)胞系和正常尿路移行上皮細(xì)胞系中miR-34a-5p的表達(dá)量,原位雜交法檢測(cè)有隨訪信息的膀胱癌組織芯片中miR-34a-5p的相對(duì)表達(dá)豐度。BSP測(cè)序分析miR-34a-5p啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化情況。在線生物信息學(xué)分析可能與miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,通過敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)等方法驗(yàn)證所選轉(zhuǎn)錄因子與miR-34a-5p的共表達(dá)關(guān)系,通過染色質(zhì)免疫共沉淀定位轉(zhuǎn)錄因子在miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的結(jié)合位點(diǎn)。2)在膀胱癌細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)miR-34a-5p,通過CCK-8、克隆形成、流式細(xì)胞周期檢測(cè)探索miR-34a-5p對(duì)膀耽癌細(xì)胞系生物學(xué)功能影響。通過western blot篩選文獻(xiàn)中已證實(shí)的相關(guān)功能的靶點(diǎn),利用熒光素雙報(bào)告驗(yàn)證miR-34a-5p與該靶點(diǎn)的直接結(jié)合。進(jìn)一步通過敲低過表達(dá)等實(shí)驗(yàn)探尋調(diào)控miR-34a-5p的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)膀胱癌生物學(xué)功能的影響及可能的機(jī)制,并在小鼠腫瘤模型中驗(yàn)證miR-34a-5p在膀脫癌中的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果1)4個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中的miR-34a-5p表達(dá)量較正常尿路移行上皮細(xì)胞系明顯降低(p0.05)。miR-34a-5p在膀胱癌組織中的表達(dá)量總體低于癌旁正常組織(p0.0001),且低表達(dá)miR-34a-5p與較低的總生存相關(guān)(p0.05)。利用在線CpG島預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp以內(nèi)有三個(gè)的CpG島,利用BSP測(cè)序法檢測(cè)3個(gè)CpG島的甲基化水平,發(fā)現(xiàn)在UM-UC-3中,3個(gè)CpG島都表現(xiàn)出高度的DNA甲基化,在T24中,2個(gè)遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的CpG島甲基化水平較高,而離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)近的1個(gè)CpG島甲基化水平較低,只有在接近miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的6-9位的CpG位點(diǎn)存在一致的高甲基化。2)在線生物信息學(xué)網(wǎng)址預(yù)測(cè)到數(shù)個(gè)可能與miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。檢測(cè)幾種轉(zhuǎn)錄因子和miR-34a-5p在4個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)CTCF與miR-34a-5p的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。敲低過表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 CTCF與miR-34a-5p及其母基因的表達(dá)負(fù)相關(guān)性。利用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)定位CTCF的結(jié)合位點(diǎn)在miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游500-700bp左右的位置。利用小分子抑制劑及ChIP/Re-ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)HDAC1也與CTCF結(jié)合在同一位點(diǎn)共同調(diào)控miR-34a-5p表達(dá)。另外,我們還發(fā)現(xiàn)敲低CTCF后,接近miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的CpG島甲基化水平降低。3)miR-34a-5p過表達(dá)、敲低CTCF和HDAC1抑制劑皆能通過G1期阻滯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖,通過過表達(dá)和抑制體實(shí)驗(yàn)、以及雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-34a-5p在膀胱癌中直接靶向抑制CDK6的表達(dá)。敲低CDK6實(shí)驗(yàn)及敲低后回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDK6是膀胱癌G1期過渡的重要蛋白。4)p15和p16是抑制CDK6活性的主要因子。經(jīng)過敲低和過表達(dá)CTCF實(shí)驗(yàn)以及染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)p15和p16表達(dá)受CTCF的轉(zhuǎn)錄抑制。然而單獨(dú)敲低CTCF并未影響CDK6的表達(dá)量,但HDAC1抑制劑與敲低CTCF聯(lián)合治療后,CDK6表達(dá)降低;再利用針對(duì)miR-34a-5p母基因轉(zhuǎn)錄本的siRNA干擾上述過程,證實(shí)HDAC1抑制劑與敲低CTCF聯(lián)合治療所導(dǎo)致的CDK6表達(dá)降低至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄激活miR-34a-5p所致。裸鼠移植瘤模型中證實(shí),與對(duì)照組相比,shCTCF+HDAC1抑制劑組腫瘤體積較小,而miR-34a-5p表達(dá)量升高,CDK6表達(dá)量減少。5)通過檢索在線生存曲線分析網(wǎng)址發(fā)現(xiàn),高表達(dá)和低表達(dá)CTCF的膀胱癌患者生存曲線無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.197),高表達(dá)CDK6的生存期顯著低于低表達(dá)組(P=0.048),高表達(dá)CDK6的平均相對(duì)生存期是0.82,而低表達(dá)組是0.95。結(jié)論1)miR-34a-5p在膀胱癌細(xì)胞系中低表達(dá),而"CTCF/HDAC1-DNA甲基化"形成的復(fù)合因素共同轉(zhuǎn)錄抑制miR-34a-5p的表達(dá)。2)miR-34a-5p通過直接靶向CDK6,使膀胱癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,進(jìn)而抑制其增殖。3)敲低CTCF和HDAC1抑制劑皆能通過G1期阻滯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。CTCF又能轉(zhuǎn)錄抑制p15/p16表達(dá),而p15和p16是抑制CDK6活性的主要因子。HDAC1抑制劑與敲低CTCF聯(lián)合治療能使CDK6表達(dá)降低,而且這種作用至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄激活miR-34a-5p所致。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號(hào)：1289678