本文關(guān)鍵詞：CTCF轉(zhuǎn)錄抑制miR-34a-5p及其在膀胱癌中的抑癌作用和分子機制研究

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【摘要】：背景:膀胱癌是我國泌尿系腫瘤中發(fā)病率最高的一種,其死亡率也是泌尿系腫瘤中的首位,全國范圍內(nèi),男性膀胱癌發(fā)病率居于所有男性惡性腫瘤第七位,女性膀胱癌的發(fā)病率則居于十五位以后。膀胱癌是源于尿路移行上皮細胞的癌癥,大約三分之一的膀胱癌在診斷時就已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移。膀胱癌生物學行為復(fù)雜,易復(fù)發(fā)易轉(zhuǎn)移,5年生存率只有62%,但是根治性膀胱癌切除仍然是治療膀胱癌的金標準。如何通過分子機制的研究尋找診斷或治療膀胱癌的新標志和新靶點,仍是目前膀胱癌研究的熱點問題。microRNA(miRNA)是一種長度約為19～22nt的內(nèi)源性非編碼RNA,其主要作用就是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達量。許多microRNA的表達量在不同的組織器官中,乃至不同的生理病理過程中都有特異性的表達差異。而在腫瘤中microRNA的特征性表達譜正是由于腫瘤中調(diào)控microRNA表達的相關(guān)因素發(fā)生了變化。作為經(jīng)典的抑癌microRNA,miR-34a-5p在膀胱癌中的抑癌作用也已被證實,而其在膀胱癌中表達調(diào)控的機制尚不清楚。目的驗證miR-34a-5p在膀胱癌細胞中的表達量,通過DNA甲基化的檢測和尋找在膀胱癌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-34a-5p的因子,探討膀胱癌中的miR-34a-5p的表達調(diào)控機制。并采用功能實驗驗證miR-34a-5p及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在膀胱癌細胞系中的生物學功能,明確其作用靶點及其對膀胱癌患者生存的影響。方法1)通過實時定量熒光PCR分析膀胱癌細胞系和正常尿路移行上皮細胞系中miR-34a-5p的表達量,原位雜交法檢測有隨訪信息的膀胱癌組織芯片中miR-34a-5p的相對表達豐度。BSP測序分析miR-34a-5p啟動子區(qū)的DNA甲基化情況。在線生物信息學分析可能與miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點附近結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,通過敲低和過表達實驗等方法驗證所選轉(zhuǎn)錄因子與miR-34a-5p的共表達關(guān)系,通過染色質(zhì)免疫共沉淀定位轉(zhuǎn)錄因子在miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點附近的結(jié)合位點。2)在膀胱癌細胞系中穩(wěn)定過表達miR-34a-5p,通過CCK-8、克隆形成、流式細胞周期檢測探索miR-34a-5p對膀耽癌細胞系生物學功能影響。通過western blot篩選文獻中已證實的相關(guān)功能的靶點,利用熒光素雙報告驗證miR-34a-5p與該靶點的直接結(jié)合。進一步通過敲低過表達等實驗探尋調(diào)控miR-34a-5p的轉(zhuǎn)錄因子對膀胱癌生物學功能的影響及可能的機制,并在小鼠腫瘤模型中驗證miR-34a-5p在膀脫癌中的調(diào)控機制。結(jié)果1)4個膀胱癌細胞系中的miR-34a-5p表達量較正常尿路移行上皮細胞系明顯降低(p0.05)。miR-34a-5p在膀胱癌組織中的表達量總體低于癌旁正常組織(p0.0001),且低表達miR-34a-5p與較低的總生存相關(guān)(p0.05)。利用在線CpG島預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp以內(nèi)有三個的CpG島,利用BSP測序法檢測3個CpG島的甲基化水平,發(fā)現(xiàn)在UM-UC-3中,3個CpG島都表現(xiàn)出高度的DNA甲基化,在T24中,2個遠離轉(zhuǎn)錄起始位點的CpG島甲基化水平較高,而離轉(zhuǎn)錄起始位點近的1個CpG島甲基化水平較低,只有在接近miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點附近的6-9位的CpG位點存在一致的高甲基化。2)在線生物信息學網(wǎng)址預(yù)測到數(shù)個可能與miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點附近結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。檢測幾種轉(zhuǎn)錄因子和miR-34a-5p在4個膀胱癌細胞系中的表達量,發(fā)現(xiàn)CTCF與miR-34a-5p的表達呈明顯的負相關(guān)。敲低過表達實驗驗證了 CTCF與miR-34a-5p及其母基因的表達負相關(guān)性。利用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗定位CTCF的結(jié)合位點在miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點下游500-700bp左右的位置。利用小分子抑制劑及ChIP/Re-ChIP實驗證實HDAC1也與CTCF結(jié)合在同一位點共同調(diào)控miR-34a-5p表達。另外,我們還發(fā)現(xiàn)敲低CTCF后,接近miR-34a-5p轉(zhuǎn)錄起始位點的CpG島甲基化水平降低。3)miR-34a-5p過表達、敲低CTCF和HDAC1抑制劑皆能通過G1期阻滯抑制膀胱癌細胞增殖,通過過表達和抑制體實驗、以及雙報告實驗證實miR-34a-5p在膀胱癌中直接靶向抑制CDK6的表達。敲低CDK6實驗及敲低后回復(fù)實驗證實CDK6是膀胱癌G1期過渡的重要蛋白。4)p15和p16是抑制CDK6活性的主要因子。經(jīng)過敲低和過表達CTCF實驗以及染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,我們證實p15和p16表達受CTCF的轉(zhuǎn)錄抑制。然而單獨敲低CTCF并未影響CDK6的表達量,但HDAC1抑制劑與敲低CTCF聯(lián)合治療后,CDK6表達降低;再利用針對miR-34a-5p母基因轉(zhuǎn)錄本的siRNA干擾上述過程,證實HDAC1抑制劑與敲低CTCF聯(lián)合治療所導致的CDK6表達降低至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄激活miR-34a-5p所致。裸鼠移植瘤模型中證實,與對照組相比,shCTCF+HDAC1抑制劑組腫瘤體積較小,而miR-34a-5p表達量升高,CDK6表達量減少。5)通過檢索在線生存曲線分析網(wǎng)址發(fā)現(xiàn),高表達和低表達CTCF的膀胱癌患者生存曲線無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.197),高表達CDK6的生存期顯著低于低表達組(P=0.048),高表達CDK6的平均相對生存期是0.82,而低表達組是0.95。結(jié)論1)miR-34a-5p在膀胱癌細胞系中低表達,而"CTCF/HDAC1-DNA甲基化"形成的復(fù)合因素共同轉(zhuǎn)錄抑制miR-34a-5p的表達。2)miR-34a-5p通過直接靶向CDK6,使膀胱癌細胞發(fā)生G1期阻滯,進而抑制其增殖。3)敲低CTCF和HDAC1抑制劑皆能通過G1期阻滯抑制膀胱癌細胞增殖。CTCF又能轉(zhuǎn)錄抑制p15/p16表達,而p15和p16是抑制CDK6活性的主要因子。HDAC1抑制劑與敲低CTCF聯(lián)合治療能使CDK6表達降低,而且這種作用至少部分是由于其轉(zhuǎn)錄激活miR-34a-5p所致。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 Shafqat Ali Khan;Divya Reddy;Sanjay Gupta;;Global histone post-translational modifications and cancer:Biomarkers for diagnosis,prognosis and treatment?[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年04期

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3 魏礦榮,陳振雄,梁智恒,何方方,林茂合,歐小文;中山市1970～1999年膀胱癌發(fā)病趨勢分析[J];中國腫瘤;2005年04期

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本文編號：1289678