發(fā)布時間：2017-12-13 21:34

  本文關鍵詞：間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的作用與機制研究

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【摘要】：多發(fā)性硬化是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特點的自身免疫性疾病,目前尚無安全有效的治療方法。實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠是研究多發(fā)性硬化常用的動物模型。白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物,具有抗炎抗氧化特性,研究顯示其對多種自身免疫性疾病有治療作用。間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能、免疫調(diào)控和自我復制等特點,對多發(fā)性硬化有潛在的治療作用。我們通過探討間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的作用和機制,為治療多發(fā)性硬化提供新的思路。本研究分三部分,現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。第一部分白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障完整性的影響目的:研究白藜蘆醇對于實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的疾病進程緩解的機制,探究白藜蘆醇對EAE小鼠的血腦屏障完整性的影響。方法:使用8-10周齡的C57BL/6雌鼠實驗,將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成5mg/ml,并按1:1等體積加入完全弗氏佐劑(其中結核桿菌H37Ra終濃度為4mg/ml)混合,乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱兩側分四點皮下注射,第0h及第48h腹腔注射500ng 0.5ml百日咳毒素(PTX),建立EAE小鼠模型。免疫在乙醚麻醉和充分固定下進行。采用Knoz 5分評分法對實驗小鼠臨床評分。通過50天觀察小鼠的臨床評分,來判斷EAE小鼠使用或者不使用不同劑量白藜蘆醇處理前后臨床評分情況。在免疫后21天通過小鼠尾靜脈注射伊文思藍染液后將小鼠腦組織速凍,切片拍照觀察腦部的完整性;通過免疫印跡技術檢測白藜蘆醇處理后跨膜緊密連接蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表達情況。并同時檢測細胞間粘連分子ICAM-1和血管粘附蛋白VCAM-1的表達變化。利用實時定量PCR檢測促炎基因i NOS和IL-1、抗炎基因arginase 1及NADPH氧化酶的表達;ELISA法檢測血清細胞因子IL-10水平。利用lucigenin實驗檢測NADPH氧化酶的活性,從而觀察白藜蘆醇對氧化壓力的緩解作用。結果:1白藜蘆醇治療能夠降低EAE小鼠的疾病嚴重性。在50天的觀察期內(nèi),使用10 mg/kg的白藜蘆醇并不能抑制疾病的發(fā)生進程,高劑量25mg/kg和50 mg/kg均能顯著的降低EAE的疾病嚴重性,使用25mg/kg和50 mg/kg的白藜蘆醇相對于PBS組的平均和最大臨床評分都顯著降低。2使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇處理EAE小鼠與對照組相比,可以顯著的防止伊文思藍染液進入腦部的量。而10mg/kg的白藜蘆醇效果與對照組沒有顯著差異。3白藜蘆醇處理可以顯著改善EAE誘導的緊密連接蛋白的丟失。通過免疫印跡技術檢測發(fā)現(xiàn)ZO-1、occludin和claudin-5的表達在EAE小鼠中顯著降低,而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇可以顯著抑制ZO-1,occludin和claudin-5蛋白的丟失。4白藜蘆醇能夠抑制EAE小鼠腦組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白的上調(diào)。免疫印跡結果顯示在EAE小鼠腦組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達顯著升高。而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇處理可以降低ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達。5在EAE小鼠中促炎基因i NOS和IL-1顯著的升高,25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇可以顯著抑制兩者的水平,而同樣在EAE小鼠中,局部的抗炎基因arginase 1和細胞因子IL-10的表達輕微的上調(diào),使用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇后可以顯著上調(diào)兩者的表達,而10mg/kg白藜蘆醇并不影響這兩種分子的表達。6白藜蘆醇可以顯著抑制EAE小鼠NADPH氧化酶(NOX)的表達量和活性。EAE小鼠表達有升高的NOX1、NOX2和NOX4。白藜蘆醇的處理并不影響NOX1的表達,但是可以顯著抑制NOX2和NOX4的上調(diào),用25mg/kg或是50mg/kg白藜蘆醇同樣也可以抑制EAE小鼠中NADPH氧化酶的活性。第二部分白藜蘆醇對間充質(zhì)干細胞在氧化應激和炎癥環(huán)境的保護作用目的:小鼠來源的間充質(zhì)干細胞已經(jīng)被證明對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠有一定的神經(jīng)保護作用,但是由于腦脊髓炎小鼠體內(nèi)的氧化應激環(huán)境和炎癥環(huán)境容易影響間充質(zhì)干細胞的生物活性,進而影響干細胞的治療效果。我們通過體外實驗探討白黎蘆醇對間充質(zhì)干細胞在這兩種環(huán)境下的保護作用。方法:從6-8周齡的C57BL/6的腿骨中取出骨髓細胞,進行傳代培養(yǎng),取第4代培養(yǎng)細胞用于實驗研究。使用抗Sca-1,CD14,CD34,CD44和CD45的抗體標記,通過流式細胞術鑒定從小鼠體內(nèi)提取的間充質(zhì)干細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞(m BM-MSCs)分別經(jīng)過20ng/ml的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或500m M的過氧化氫(H_2O_2)的處理,TNF在培養(yǎng)環(huán)境中持續(xù)存在;過氧化氫處理4小時。在體外培養(yǎng)的第1,3和5天MTT法測定細胞增殖和上清液乳酸脫氫酶(LDH)測定細胞損傷;應用不同濃度的白藜蘆醇(0.1、1、10μmol/L)預處理m BM-MSCs,重復上述培養(yǎng)過程。結果:1采用貼壁持續(xù)培養(yǎng)的小鼠骨髓細胞經(jīng)流式抗體標記,鑒定后確實帶有間充質(zhì)干細胞的表面標記蛋白。使用抗Sca-1,CD14,CD34,CD44和CD45的抗體標記,通過流式細胞術鑒定出從小鼠體內(nèi)提取出的骨髓細胞經(jīng)體外培養(yǎng)6周后,分離出帶有間充質(zhì)干細胞表型的一群細胞亞群,而這群細胞主要是小鼠來源的間充質(zhì)干細胞。2白藜蘆醇能夠降低H_2O_2和TNF-α誘導的細胞毒性。通過MTT檢測細胞活性并檢測上清液LDH的泄漏表明,H_2O_2(500 m M)或是TNF-α(20 ng/m L)能夠顯著降低細胞生存并升高LDH的泄漏。而白藜蘆醇能夠降低這種細胞毒性。第三部分間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的影響目的:研究間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療緩解EAE小鼠疾病進程的機制,探究聯(lián)合治療對EAE小鼠炎癥的作用。方法:通過觀察小鼠的臨床評分,來判斷EAE小鼠使用間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇處理的效果。通過HE染色和抗CD4的免疫組化檢測單核細胞和T淋巴細胞對于脊髓組織的浸潤。利用ELISA檢測白藜蘆醇和間充質(zhì)干細胞處理后EAE小鼠血清中Th1型細胞因子IFN-γ/TNF-α和Th2型細胞因子IL-4/IL-10的表達量。結果:1間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療能夠顯著降低EAE小鼠的疾病嚴重程度。使用白藜蘆醇聯(lián)合間充質(zhì)干細胞可以顯著的延緩EAE疾病進程。間充質(zhì)干細胞或是白藜蘆醇治療后能夠顯著降低平均的臨床評分(PBS處理組中平均臨床評分為2.63±0.42;m BM-MSCs處理組1.34±0.31;白藜蘆醇處理組1.44±0.38;PBS組與m BM-MSCs相比P0.01;PBS組與白藜蘆醇處理組相比P0.01)和最大臨床評分(PBS組3.76±0.32;m BM-MSCs處理組1.83±0.27;白藜蘆醇處理組1.74±0.31;PBS組與m BM-MSCs組相比P0.01;PBS與白藜蘆醇組相比P0.01)。而兩者聯(lián)用比單獨使用效果更好(聯(lián)用的平均臨床評分0.64±0.27;m BM-MSCs組與聯(lián)用相比P0.01;白藜蘆醇組與聯(lián)用相比P0.01;聯(lián)用最大臨床評分0.91±0.22;m BM-MSCs組與聯(lián)用組相比P0.01;白藜蘆醇處理組與聯(lián)用組相比P0.01)。2間充質(zhì)干細胞和白藜蘆醇聯(lián)合使用可以降低EAE小鼠脊髓中的炎癥細胞數(shù)目。使用HE染色和抗CD4的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)EAE小鼠脊髓中的炎性單核細胞和T細胞的浸潤顯著升高,而單獨使用間充質(zhì)干細胞或是白藜蘆醇與PBS組對比可以顯著降低浸潤細胞的數(shù)目(PBS組與m BM-MSCs處理組相比P0.05;PBS組與白藜蘆醇處理組相比P0.01),而間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇可以更加顯著的降低炎性細胞的浸潤(m BM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P0.01;白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P0.01)。3間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇能夠促進EAE小鼠中Th1型向Th2型細胞因子的轉變。在單獨使用間充質(zhì)干細胞或是白藜蘆醇處理的EAE小鼠中Th1型細胞因子IFN-γ/TNF-α顯著的降低,而Th2型細胞因子IL-4/IL-10的表達量顯著升高(IFN-γ:PBS處理組與m BM-MSCs處理組P0.01;PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P0.01;TNF-α:PBS處理組與m BM-MSCs處理組相比P0.01;PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P0.01;IL-4:PBS處理組與m BM-MSCs處理組相比P0.01;PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P0.01;IL-10:PBS處理組與m BM-MSCs處理組相比P0.01;PBS處理組與白藜蘆醇處理組相比P0.01)。而間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療后這種細胞因子轉換效果更加顯著。(IFN-γ:m BM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P0.01;白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P0.05;TNF-α:m BM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P0.05;白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P0.05;IL-4:m BM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P0.05;白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P0.05;IL-10:m BM-MSCs處理組與聯(lián)合治療組相比P0.01;白藜蘆醇處理組與聯(lián)合治療組相比P0.01)。結論:1白藜蘆醇可以顯著保護EAE小鼠的血腦屏障完整性。白藜蘆醇單獨使用可以有效降低EAE疾病的嚴重性,可以顯著的防止伊文思藍染液進入腦部的量�？赡苁峭ㄟ^抑制緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的丟失,抑制EAE小鼠腦組織中上調(diào)的粘附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白,抑制EAE小鼠促炎基因i NOS和IL-1的表達,上調(diào)抗炎基因arginase 1和細胞因子IL-10的表達,抑制EAE小鼠NADPH氧化酶的表達量和活性來實現(xiàn)。2 H_2O_2或是TNF-α模擬的氧化應激和炎癥環(huán)境能夠顯著降低間充質(zhì)干細胞生存并升高LDH的泄漏。白藜蘆醇能夠降低H_2O_2和TNF-α誘導的對間充質(zhì)干細胞的細胞毒性作用。3間充質(zhì)干細胞聯(lián)合白藜蘆醇治療可以顯著的延緩EAE疾病進程,同時聯(lián)合治療能夠顯著降低小鼠EAE模型的疾病嚴重性,從而改善EAE疾病的臨床評分�？梢越档虴AE小鼠脊髓中的炎癥細胞數(shù)目,并且間充質(zhì)干細胞和白藜蘆醇能夠促進EAE小鼠中Th1型向Th2型細胞因子的轉變。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R744.51

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8 吳清法,王立生,吳祖澤;間充質(zhì)干細胞的來源及臨床應用[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2002年03期

9 黃定強;間充質(zhì)干細胞的研究進展[J];國外醫(yī)學(耳鼻咽喉科學分冊);2003年03期

10 付文玉,路艷蒙,喬東訪,樸英杰;運用組織工程學原理構建間充質(zhì)干細胞的三維培養(yǎng)體系[J];濰坊醫(yī)學院學報;2003年03期

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1 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

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3 李爭艷;劉楊;翟麗麗;楊迷玲;王立峰;;間充質(zhì)干細胞在腫瘤發(fā)展過程中的作用[A];中華醫(yī)學會病理學分會2009年學術年會論文匯編[C];2009年

4 張彥;李尚珠;;間充質(zhì)干細胞在血管工程中的機制及應用[A];2009全國中西醫(yī)結合周圍血管疾病學術交流會論文集[C];2009年

5 石玉;戴\戎;;周期性拉應力對間充質(zhì)干細胞分化影響的研究[A];第九屆全國生物力學學術會議論文匯編[C];2009年

6 黎嬌;朱爭艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質(zhì)干細胞分泌物對肝細胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第30次學術年會暨生物醫(yī)學工程前沿科學研討會論文集[C];2010年

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8 唐佩弦;;間充質(zhì)干細胞及其臨床應用前景[A];第三屆全國血液免疫學學術大會論文集[C];2003年

9 戴育成;;間充質(zhì)干細胞的生物學特性和應用[A];2005年華東六省一市血液病學學術會議暨浙江省血液病學學術年會論文匯編[C];2005年

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1 滿學杰;天津濱海新區(qū)建最大間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)基地[N];新華每日電訊;2008年

2 滿學杰;津昂賽打造間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)基地[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2008年

3 第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質(zhì)干細胞研究又見新方法[N];健康報;2013年

4 上海生科院 上海交大醫(yī)學院健康科學研究所 曹楷;間充質(zhì)干細胞：干細胞中的孫悟空[N];上海科技報;2014年

5 記者　陳建強;首家間充質(zhì)干細胞庫在津建成[N];光明日報;2006年

6 記者　馮國梧;細胞產(chǎn)品國家工程中心建設方案獲準[N];科技日報;2007年

7 實習生 劉霞;間充質(zhì)干細胞有望用于面部整形[N];科技日報;2007年

8 本報記者 王新佳;我國“原始間充質(zhì)干細胞”注射液進入臨床研究[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2005年

9 馮國梧;全球首個臍帶間充質(zhì)干細胞庫規(guī)�；\營[N];科技日報;2008年

10 劉瑩清;全球首個臍帶間充質(zhì)干細胞庫泰達規(guī)模運營[N];北方經(jīng)濟時報;2008年

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1 王皓;五指山小型豬OCT-4、SOX-2基因在骨髓間充質(zhì)與臍帶間充質(zhì)干細胞中的過表達研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2013年

2 孔德曉;間充質(zhì)干細胞及胰島素分泌細胞治療糖尿病的臨床及應用基礎研究[D];山東大學;2015年

3 董苑;SDF-1復合PDPBB的構建及對間充質(zhì)干細胞趨化影響的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

4 王磊;誘導胎盤來源間充質(zhì)干細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化的實驗研究[D];山東大學;2015年

5 房賀;連接黏附分子A在促進MSC修復CC14肝損傷中的作用及其機制[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

6 陳潔;間充質(zhì)干細胞外泌體對急性肺損傷小鼠的影響及相關機制的實驗研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2015年

7 許婷;轉化生長因子β1在蟑螂過敏原誘導的哮喘中對間充質(zhì)干細胞募集遷移的影響[D];南方醫(yī)科大學;2015年

8 周雅麗;攜氧間充質(zhì)干細胞對胃癌化療效果的影響及其機制研究[D];蘭州大學;2015年

9 沈舒寧;CKIP-1負調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

10 朱鎮(zhèn);外源性骨礦化蛋白1轉染人胎盤源間充質(zhì)干細胞及其蛋白質(zhì)組研究[D];吉林大學;2016年

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1 李超;小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中AC基因亞型的表達及AC3對其纖毛長度的影響[D];河北大學;2015年

2 林濤;殼聚糖水凝膠復合脂肪間充質(zhì)干細胞修復兔關節(jié)軟骨缺損的實驗研究[D];川北醫(yī)學院;2015年

3 彭龍英;心肌營養(yǎng)素1促進人臍血間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化存活及PI3K/Akt信號通路機制研究[D];遵義醫(yī)學院;2015年

4 喬曉慧;酸性環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細胞的影響[D];內(nèi)蒙古大學;2015年

5 張紅霞;人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、鑒定及其對人肺癌細胞惡性表型的影響[D];內(nèi)蒙古大學;2015年

6 顧立超;BTK抑制劑對間充質(zhì)干細胞miR-21的調(diào)節(jié)作用[D];河北聯(lián)合大學;2014年

7 王文杰;鴨胚間充質(zhì)干細胞生物學特性及其移植修復肝損傷研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

8 張猛;血管內(nèi)皮前體細胞對間充質(zhì)干細胞分化潛能的影響[D];石河子大學;2015年

9 馬麗媛;利用MyoD基因誘導綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

10 宋維文;MicroRNA-133誘導綿羊間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

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