本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞核因子HNF1α在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：【研究背景及目的】隨著全球肥胖人群的不斷增多,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成一種常見疾病,其發(fā)病呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢(shì)。近年來,多項(xiàng)研究證明,NAFLD患者常與肥胖、高血糖、高血脂、高血壓等疾病伴隨發(fā)生,與2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)、代謝綜合征以及心、腦血管疾病密切相關(guān)。NAFLD和T2DM的共同發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗,兩者相互促進(jìn),相互惡化,已成為近年來臨床治療的新挑戰(zhàn)。肝細(xì)胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNFs)是一類在肝臟優(yōu)勢(shì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,目前已發(fā)現(xiàn)的HNF成員包括5種,它們分別是HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)。HNFs通過準(zhǔn)確調(diào)控下游多種重要的肝細(xì)胞功能基因表達(dá),在肝臟發(fā)育和肝細(xì)胞分化以及功能維持中起關(guān)鍵作用。其中HNF1α是HNFs家族的主要成員之一,屬于POU-同源結(jié)構(gòu)域家族。HNF1α在肝臟中表達(dá)水平最高,在腎臟、小腸、胰腺β細(xì)胞中也有一定的表達(dá),它對(duì)肝臟中許多的重要功能基因進(jìn)行調(diào)控,對(duì)肝臟的發(fā)育中是不可或缺的。以往針對(duì)HNF1α的研究中分為兩方面:(1)HNF1α全身敲除小鼠出現(xiàn)高血糖和高脂血癥。(2)HNF1α基因失活突變后,異常的HNF1α蛋白抑制肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)的功能,使肝細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能損害,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。以上研究結(jié)果提示HNF1α可能是脂肪肝和糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的抑制因子,但該推論還需進(jìn)一步證實(shí)�；谝陨涎芯勘尘�,本研究首先通過建立NAFL模型小鼠,觀察HNF1α在其肝臟中的表達(dá)變化,分析相關(guān)性;利用Cre-Lox P重組酶系統(tǒng),首次獲得了肝細(xì)胞特異性敲除HNF1α小鼠,通過該小鼠研究分析HNF1α在NAFLD形成過程中發(fā)揮的作用,探究胰島素抵抗和血糖升高是否會(huì)促進(jìn)NAFLD患者肝臟出現(xiàn)不良結(jié)局,如肝硬化或肝癌等;運(yùn)用腺相關(guān)病毒特異性上調(diào)肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá),觀察其是否能改善NAFLD癥狀;利用以上模型進(jìn)一步探索其中的機(jī)制�！緦�(shí)驗(yàn)方法】一、HNF1α在NAFL模型小鼠肝臟中的表達(dá)情況利用高脂飼料建立了非酒精性脂肪肝模型小鼠。利用IPGTT方法檢測(cè)小鼠末梢血糖情況,通過肝組織病理學(xué)染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn),從而判斷造模是否成功。提取肝臟組織RNA,通過Real-time PCR檢測(cè)肝組織中糖脂代謝基因ACC、FAS、SREBP-1c、GCK、PEPCK和炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的表達(dá)量,提取肝臟組織RNA和蛋白,利用Real-time PCR、western blot和免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)肝組織中HNF1α的表達(dá)水平。二、特異性調(diào)控肝細(xì)胞HNF1α對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的作用1、Hnf1αH-KO小鼠的建立利用基因打靶技術(shù)建立Hnf1af/f小鼠,將Hnf1af/f小鼠與Alb-Cre小鼠雜交,獲得的雜合子小鼠之間再次雜交后,可獲得Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)兩種基因型小鼠。通過鼠尾DNA抽提,普通PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)小鼠基因型,并根據(jù)結(jié)果將Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)兩種基因型小鼠進(jìn)行區(qū)分并分組。2、各組織和肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)情況的檢測(cè)提取Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟、胰腺、小腸和腎臟組織RNA和蛋白,利用Real-time PCR、western blot和免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)HNF1αm RNA和蛋白的表達(dá)水平。分離Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)小鼠原代肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,提取細(xì)胞中的蛋白,利用western blot方法檢測(cè)HNF1α蛋白的表達(dá)水平。3、Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及糖脂代謝基因檢測(cè)處死10周齡、30周齡Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)小鼠,通過肝組織病理學(xué)染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn),并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估。收集Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)小鼠血清,檢測(cè)小鼠血清中CHOL、TG、LDL-C3和ALT的表達(dá)水平。利用Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)小鼠肝組織勻漿檢測(cè)肝組織中TG表達(dá)量。提取Hnf1af/f和Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟RNA和蛋白,利用Real-time PCR和western blot方法,檢測(cè)糖脂代謝相關(guān)基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纖維化相關(guān)基因Collagen 1、α-SMA的表達(dá)水平。4、于NAFL模型小鼠中特異性上調(diào)肝細(xì)胞HNF1α表達(dá)(1)空白對(duì)照組(CTR AAV-TBG)的建立:普通飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠5只,于第10周尾靜脈AAV-TBG(2×1011 Vg/只,1次),于第20周時(shí)處死小鼠(2)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的建立(HFD AAV-TBGHFD AAV-HNF1α):高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠建立NAFL模型小鼠,于高質(zhì)飲食第10周將NAFL模型小鼠隨機(jī)分為2組,每組各5只,分別通過尾靜脈注射AAV-TBG和AAV-HNF1α(2×1011 Vg/只,1次),于第20周處死各組小鼠5、觀察NAFL模型小鼠肝細(xì)胞過表達(dá)HNF1α后肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及肝臟糖脂代謝基因的檢測(cè)取CTR AAV-TBG組、HFD AAV-TBG組和HFD AAV-HNF1α組小鼠肝組織進(jìn)行病理學(xué)染色并觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化。提取以上三組小鼠肝組織中RNA和蛋白,利用Real-time PCR和western blot方法,檢測(cè)糖脂代謝相關(guān)基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纖維化相關(guān)基因Collagen 1、α-SMA的表達(dá)水平。三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究1、利用10周齡、30周齡和70周齡Hnf1a~(H-KO)小鼠,通過Real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)肝組織中炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的m RNA和蛋白水平,通過western blot方法檢測(cè)肝組織STAT3和p65的蛋白水平。2、利用10周齡Hnf1a~(H-KO)小鼠原代肝細(xì)胞,通過Real-time PCR方法檢測(cè)原代肝細(xì)胞中炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的m RNA水平,通過western blot方法檢測(cè)原代肝細(xì)胞中STAT3和p65的蛋白水平。3、利用CTR AAV-TBG組、HFD AAV-TBG組和HFD AAV-HNF1α組小鼠,利用免疫組化方法,檢測(cè)肝臟內(nèi)炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的蛋白表達(dá),通過western blot方法檢測(cè)肝臟內(nèi)STAT3和p65的蛋白水平。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析,多組間采用One-Way ANOVA分析,配對(duì)資料采用配對(duì)t檢驗(yàn),方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±SD表示,P0.05具有顯著差異,P0.01具有非常顯著差異�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】一、HNF1α在NAFL模型小鼠肝臟中的表達(dá)情況(1)NAFL模型小鼠肝臟出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積,于高脂飲食30wk時(shí)小鼠血糖升高,出現(xiàn)肝纖維化;(2)與對(duì)照組小鼠相比,NAFL模型小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACC、FAS和SREBP-1c等m RNA的表達(dá)明顯升高;(3)與對(duì)照組小鼠相比,NAFL模型小鼠糖代謝關(guān)鍵酶GCK m RNA的表達(dá)顯著降低,糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK m RNA的表達(dá)明顯升高;(4)與對(duì)照組小鼠相比,NAFL模型小鼠炎癥因子TNFα、TGFβ和IL-6 m RNA的表達(dá)明顯升高;(5)與對(duì)照組小鼠相比,NAFL模型小鼠HNF1α基因m RNA的表達(dá)量在高脂飲食10wk時(shí)出現(xiàn)一過性升高后,于高脂飲食30wk時(shí)明顯下調(diào),western blot和免疫組化進(jìn)一步確定NAFL模型小鼠肝臟中HNF1α的蛋白水平于高脂飲食30wk時(shí)表達(dá)顯著下降。二、特異性調(diào)控肝細(xì)胞HNF1α對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的作用1、Hnf1a~(H-KO)小鼠各組織和肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)的檢測(cè)(1)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟中HNF1αm RNA和蛋白的表達(dá)明顯下降;(2)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠小腸、腎臟和胰腺中HNF1αm RNA和蛋白水平的表達(dá)沒有變化;(3)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠原代肝細(xì)胞中HNF1α蛋白水平的表達(dá)明顯降低;(4)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中HNF1α蛋白水平的表達(dá)沒有變化。2、Hnf1αH-KO小鼠血脂、肝功能及血糖情況的檢測(cè)(1)與Hnf1αf/f小鼠相比,Hnf1αH-KO小鼠于10周齡時(shí)出現(xiàn)血清總膽固醇(CHO-C3)明顯升高、低密度脂蛋白(LDL-C3)降低;(2)與Hnf1αf/f小鼠相比,Hnf1αH-KO小鼠谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)明顯升高;(3)與Hnf1αf/f小鼠相比,Hnf1αH-KO小鼠IPGTT檢測(cè)顯示,30周齡Hnf1αH-KO小鼠血糖水平分別于葡萄糖注射后60分鐘和90分鐘時(shí)升高。3、Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及糖脂代謝基因檢測(cè)(1)與Hnf1af/f小鼠相比,10周齡Hnf1a~(H-KO)小鼠出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積,30周齡Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積加重,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),出現(xiàn)肝纖維化,70周齡Hnf1a~(H-KO)小鼠發(fā)生高分化型肝細(xì)胞癌;(2)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACC、FAS和SREBP-1c m RNA的表達(dá)明顯升高,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝臟內(nèi)TG含量明顯升高;(3)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠糖代謝關(guān)鍵酶GCK的m RNA表達(dá)量明顯降低,GCK-GCKR比例明顯降低;4、NAFL模型小鼠肝細(xì)胞過表達(dá)HNF1α后肝臟內(nèi)HNF1α表達(dá)的檢測(cè)(1)與CTR AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-TBG組小鼠中肝臟內(nèi)HNF1αm RNA的表達(dá)明顯下降;(2)與HFD AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-HNF1α組小鼠肝臟內(nèi)HNF1α在m RNA和蛋白水平均明顯升高,并且高于CTR AAV-TBG組小鼠肝臟內(nèi)HNF1α的表達(dá)水平。5、NAFL模型小鼠肝細(xì)胞過表達(dá)HNF1α后肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和糖脂代謝相關(guān)基因的檢測(cè)(1)與HFD AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-HNF1α組小鼠脂肪肝癥狀明顯改善,肝臟內(nèi)未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),未見肝臟內(nèi)纖維化形成;(2)與HFD AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-HNF1α組小鼠SREBP-1c、FAS和ACC m RNA的表達(dá)水平和肝組織TG含量明顯降低;(3)與HFD AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-HNF1α組小鼠中GCK m RNA的表達(dá)明顯升高,GCK-GCKR比例明顯升高。三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究1、Hnf1αH-KO小鼠肝組織中炎癥因子和NF-κB、STAT3信號(hào)通路的檢測(cè)(1)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝組織中TNFα、TGFβ1和IL-6 m RNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高;(2)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝組織中STAT3和p65磷酸化水平明顯升高。2、Hnf1αH-KO小鼠肝細(xì)胞中炎癥因子和NF-κB、STAT3信號(hào)通路的檢測(cè)(1)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝細(xì)胞中TNFα、TGFβ1和IL-6 m RNA表達(dá)水平明顯升高;(2)與Hnf1af/f小鼠相比,Hnf1a~(H-KO)小鼠肝組織中STAT3和p65磷酸化水平明顯升高。3、特異性上調(diào)NAFL模型小鼠肝細(xì)胞中HNF1α后肝臟內(nèi)炎癥因子和NF-κB、STAT3信號(hào)通路的檢測(cè)(1)與HFD AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-HNF1α組小鼠肝組織中TNFα、TGFβ1和IL-6的蛋白水平明顯降低;(2)與HFD AAV-TBG組小鼠相比,HFD AAV-HNF1α組小鼠肝組織中STAT3和p65的磷酸化水平明顯降低�！窘Y(jié)論】1、HNF1α在NAFLD小鼠肝組織中表達(dá)顯著降低,與血糖升高和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。2、肝細(xì)胞特異性缺失HNF1α后小鼠自發(fā)NAFLD,并最終進(jìn)展為肝細(xì)胞癌,提示HNF1α在NAFLD發(fā)生發(fā)展中起重要作用。3、特異性上調(diào)肝細(xì)胞HNF1α表達(dá)顯著改善NAFLD癥狀,有望成為NAFLD治療的新靶點(diǎn)。4、HNF1α可通過負(fù)向調(diào)節(jié)STAT3和NF-κB信號(hào)通路改善NAFLD的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 倪奇;肝細(xì)胞核因子HNF1α在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 趙龍;HNF1α翻譯后修飾的分子機(jī)制及生物學(xué)意義[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：1286523