發(fā)布時間：2017-12-13 07:36

  本文關(guān)鍵詞：B-Myb對結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制研究

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【摘要】：B-Myb是轉(zhuǎn)錄因子Myb基因家族的成員之一,位于染色體20q13,廣泛分布于具有增殖能力的細胞中。通過對體外培養(yǎng)的細胞進行檢測,B-Myb在細胞周期的S-期表達量最高,而且B-Myb表達量的改變影響細胞周期的進程、凋亡、致癌作用及衰老�；虮磉_譜分析顯示B-Myb在人的多種類型的惡性腫瘤中表達顯著高于相同組織來源的正常組織。促進乳腺癌細胞的克隆形成、細胞周期進程及遷移侵襲,促進肝癌細胞的增殖及G1-S和G2-M期的轉(zhuǎn)換等。這些研究表明B-Myb能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前,B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制仍不清楚,故本論文主要研究B-Myb在結(jié)腸癌樣本中的表達水平及對結(jié)腸癌細胞增殖、細胞周期、侵襲遷移、細胞凋亡及腫瘤形成等方面的影響及其分子機制。第一部分B-Myb在結(jié)腸癌樣本中的表達分析目的:檢測結(jié)腸癌組織和結(jié)腸正常組織及結(jié)腸癌不同細胞系中B-Myb表達水平,確認B-Myb與結(jié)腸癌臨床病理特征是否具有關(guān)聯(lián)。方法:應(yīng)用qRT-PCR、Western blot及免疫組化技術(shù)檢測結(jié)腸癌組織和結(jié)腸正常組織以及結(jié)腸癌不同細胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表達水平,統(tǒng)計分析B-Myb與病人的臨床病理分級、病理分期、腫瘤大小和淋巴道轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。結(jié)果:檢測49例結(jié)腸cDNA芯片、結(jié)腸癌細胞系及120例結(jié)腸組織芯片中B-Myb的mRNA和蛋白表達水平。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中B-Myb的mRNA表達水平顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達(p=0.002),其表達量與臨床病理分期關(guān)系密切(p=0.005);進一步檢測結(jié)腸癌的6個細胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)不同結(jié)腸癌細胞之間B-Myb表達量存在顯著差異,其中以SW620細胞中B-Myb表達量最高,RKO細胞中B-Myb表達量最低;通過對結(jié)腸癌患者組織芯片進行免疫組化染色,B-Myb表達主要定位于細胞漿;統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中B-Myb的蛋白表達量顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達(p0.05),且表達量與臨床分級(p0.05)及腫瘤的大小(p0.001)存在顯著性差異。結(jié)論:結(jié)腸癌組織中B-Myb的mRNA表達水平顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達,其表達量與臨床病理分期存在相關(guān)性;結(jié)腸癌的6個細胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表達水平存在顯著差異,其中以SW620細胞中B-Myb表達量最高,RKO細胞中B-Myb表達量最低;結(jié)腸癌患者B-Myb蛋白表達水平顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達,其表達量與臨床分級及腫瘤的大小存在相關(guān)性。第二部分B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用目的:明確過表達或敲降B-Myb對結(jié)腸癌細胞HCT116、HT29、SW620增殖、周期、凋亡、克隆形成及侵襲遷移的影響;檢測過表達或敲降B-Myb對結(jié)腸癌細胞HCT116在裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。方法:qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測B-Myb在結(jié)腸癌細胞HCT116、HT29、SW620中表達情況。過表達或敲降B-Myb后,流式細胞技術(shù)檢測細胞周期及凋亡,免疫熒光技術(shù)檢測DNA合成(S期)及有絲分裂(M期)的變化,劃痕實驗檢測細胞的側(cè)向遷移能力,transwell實驗檢測細胞的遷移侵襲能力,平板克隆實驗檢測細胞的克隆形成能力,裸鼠成瘤實驗檢測細胞在體內(nèi)的成瘤能力。結(jié)果:qRT-PCR和Western blot結(jié)果提示,慢病毒感染的過表達和敲降B-Myb以及si RNA瞬時轉(zhuǎn)染的細胞株構(gòu)建成功。CCK8實驗結(jié)果顯示:從72 h到96 h,B-Myb穩(wěn)定過表達HCT116和HT29細胞株的增殖能力均明顯高于對照組(P0.001);從48 h到96 h,瞬時敲降B-Myb的HCT116、HT29及SW620細胞株的增殖能力顯著低于對照組(P0.01,P0.01,P0.05);從72 h到96 h,穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116和HT29細胞株的增殖能力均顯著低于對照組(P0.01)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:HCT116和HT29細胞B-Myb過表達組的G1期細胞數(shù)量均較對照組減少(p0.05),而S期細胞數(shù)均較對照組增加(p0.01),G2/M期細胞數(shù)均較對照組增加(p0.05);HCT116和SW620細胞B-Myb被小干擾RNA敲降后,S期細胞數(shù)量均較對照組明顯減少(p0.05),G2/M期細胞數(shù)均較對照組明顯增加(p0.001,p0.01);HCT116和HT29細胞B-Myb穩(wěn)定敲降后,B-Myb穩(wěn)定敲降組的G1期細胞數(shù)量均較對照組顯著減少(p0.05,p0.001),HCT116的S期細胞數(shù)量較對照組顯著減少(p0.05),兩個細胞系中G2/M期細胞數(shù)量均較對照組顯著增加(p0.001,p0.01)。免疫熒光實驗結(jié)果顯示:HCT116和HT29細胞B-Myb過表達組處于S期的細胞數(shù)量均顯著高于對照組(p0.01,P0.001),處于M期的細胞數(shù)量也均顯著高于對照組(p0.01,P0.001);穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116細胞中,B-Myb敲降組處于S期的細胞數(shù)量顯著低于對照組(p0.001),而在穩(wěn)定敲降B-Myb的HT29細胞中,B-Myb敲降組處于S期的細胞數(shù)量高于對照組(p0.05),兩個細胞系中,B-Myb敲降組處于M期的細胞數(shù)量均高于對照組(p0.01,p0.05)。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示:HCT116和HT29細胞B-Myb過表達組細胞凋亡率均顯著低于對照組細胞凋亡率;穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116和HT29細胞組中細胞凋亡率均高于對照組細胞凋亡率。劃痕實驗結(jié)果顯示:HCT116和HT29細胞中B-Myb過表達組細胞的側(cè)向遷移能力均較對照組明顯增加。HCT116、HT29、SW620三種結(jié)腸癌細胞B-Myb瞬時敲降或穩(wěn)定敲降組細胞的側(cè)向遷移能力均較對照組下降。Transwell實驗結(jié)果顯示:B-Myb穩(wěn)定過表達的HCT116(遷移實驗,P0.001;侵襲實驗,P0.001)和HT29(遷移實驗,P0.001;侵襲實驗,P0.001)細胞穿到膜下方的數(shù)量顯著多于對照組;si RNA干擾B-Myb的HCT116和HT29細胞遷移能力均顯著低于對照組(P0.001,P0.01);B-Myb穩(wěn)定敲降的HCT116(遷移實驗,P0.001;侵襲實驗,P0.001)和HT29(遷移實驗,P0.05;侵襲實驗,P0.001)細胞穿到膜下方的數(shù)量顯著少于對照組。平板克隆實驗結(jié)果顯示:HCT116和HT29細胞B-Myb過表達組細胞的克隆團數(shù)量明顯多于對照組(P0.01,P0.05);HCT116和HT29細胞B-Myb穩(wěn)定敲降組細胞的克隆團數(shù)量均明顯少于對照組(P0.05)。裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示:HCT116細胞B-Myb穩(wěn)定過表達組(n=3)腫瘤的生長明顯快于對照組(n=3)(P0.05),瘤體的重量也顯著高于對照組(P0.01);HCT116細胞B-Myb穩(wěn)定敲降組(n=5)腫瘤的生長明顯慢于對照組(n=5)(P0.05),瘤體重量也顯著低于對照組(P0.001)。結(jié)論:B-Myb能夠促進結(jié)腸癌細胞HCT116、HT29和SW620的增殖、G1/S期轉(zhuǎn)換、細胞的側(cè)向及正向遷移、細胞侵襲及克隆形成,抑制細胞凋亡,且B-Myb過表達促進結(jié)腸癌細胞HCT116的裸鼠體內(nèi)腫瘤形成。第三部分B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究目的:探究B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制。方法:RNA-seq技術(shù)及GO數(shù)據(jù)分析、pathway數(shù)據(jù)分析篩選由B-Myb調(diào)控的下游靶基因及信號通路;qRT-PCR技術(shù)驗證篩選的靶基因的mRNA表達情況;Western blot技術(shù)驗證ERK信號通路;構(gòu)建B-Myb刪除體及點突變體,探究B-Myb的具體轉(zhuǎn)錄激活域。結(jié)果:穩(wěn)定過表達B-Myb和敲降B-Myb的慢病毒感染結(jié)腸癌細胞株HCT116的總RNA進行RNA-seq檢測,B-Myb穩(wěn)定過表達組vs對照組中表達上調(diào)的基因與B-Myb穩(wěn)定干擾組vs對照組中表達下調(diào)的基因形成交集的有1558個,B-Myb穩(wěn)定過表達組vs對照組中表達下調(diào)的基因與B-Myb穩(wěn)定干擾組vs對照組中表達上調(diào)的基因形成交集的有1962個,對兩組交集的全部基因進行GO富集分析,結(jié)果顯示:由B-Myb表達變化引起的差異表達的靶基因功能主要集中于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞生物學(xué)進程的調(diào)節(jié)、細胞增殖、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡調(diào)控、細胞生長、細胞分化及調(diào)控細胞的運動能力。通過qRT-PCR技術(shù)對差異表達的靶基因E2F1、E2F2、E2F3、E2F8、ZNF473、ESCO2、KIF11、NRP1、WISP2、DLC1、KBTBD6、IGFBP3進行驗證,結(jié)果與RNA-seq檢測結(jié)果相符;pathway富集分析,結(jié)果顯示:富集通路主要有MAPK信號通路、細胞因子間相互作用、癌癥信號通路、Rap1信號通路以及Jak-STAT信號通路,通過Western blot技術(shù)檢測證實:B-Myb過表達促進ERK及AKT的磷酸化,敲降B-Myb抑制ERK及AKT磷酸化;成功構(gòu)建B-Myb刪除體:B-Myb(aa 1-359)、B-Myb(aa 1-561)、B-Myb(aa 360-700),突變體:B-Myb(N174A)。瞬時轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定敲降B-Myb的結(jié)腸癌細胞HCT116后,通過劃痕實驗檢測刪除體及突變體對細胞生長及遷移能力的影響,結(jié)果證實,B-Myb(aa 1-359)對穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116細胞的側(cè)向遷移能力沒有明顯影響,而B-Myb(aa1-561)、B-Myb(aa 360-700)及B-Myb(N174A)能夠促進穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116細胞側(cè)向遷移能力。結(jié)論:B-Myb通過調(diào)節(jié)下游靶基因正向調(diào)節(jié)ERK及AKT信號通路在結(jié)腸癌細胞HCT116中發(fā)揮作用;B-Myb基因在結(jié)腸癌胞HCT116發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用或許主要依賴于CR(aa 369-614)功能區(qū)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

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本文編號：1284346