本文關(guān)鍵詞：低氧通過抑制miR-218激活PERK在低氧性肺動脈高壓中作用研究

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【摘要】：肺動脈高壓(PH)是一種涉及多種臨床狀況并會使大多數(shù)心血管及呼吸系統(tǒng)疾病復(fù)雜化的病理生理紊亂。有報(bào)導(dǎo)顯示PH患病率為97/百萬人,年齡標(biāo)準(zhǔn)化的死亡率為4.5-12.3/十萬人。低氧性肺動脈高壓(HPH)是由肺部疾病和(或)低氧所致的肺動脈高壓,常見于間質(zhì)性肺疾病及慢性阻塞性肺病,肺部疾病發(fā)展致PH時(shí)均伴有運(yùn)動能力的惡化,低氧加重和生存時(shí)間縮短。因此,對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究有重要意義。MicroRNA是一種長度約22nt的小分子非編碼RNA,研究顯示與肺動脈高壓相關(guān)的因素如低氧、炎癥等均可以調(diào)節(jié)microRNA的表達(dá)。近年來,microRNA作為一種上游信號分子在PH肺血管重塑中的作用受到關(guān)注,而且越來越多的研究表明,microRNA有望作為PH治療的新靶點(diǎn)。本課題組通過芯片技術(shù)在HPH大鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)了一批表達(dá)變化的microRNA,從中挑選出了表達(dá)降低的miR-218。在大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)中研究其對PASMCs增殖、遷移、凋亡的影響,并對其進(jìn)行靶基因預(yù)測和驗(yàn)證。在HPH大鼠模型中特異性抑制miR-218靶基因PERK,檢測抑制PERK對HPH肺動脈壓力及肺血管重塑的影響。本研究為HPH的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路,為HPH的治療提供了新的靶點(diǎn)。第一部分MicroRNA在低氧性肺動脈高壓大鼠模型肺組織表達(dá)譜分析目的:檢測HPH與常氧對照組大鼠肺組織中差異性表達(dá)的microRNA。方法:首先構(gòu)建HPH大鼠模型,通過右心室壓力測定(RVSP)、右心肥厚指數(shù)(RVHI)計(jì)算及HE染色確定HPH模型構(gòu)建是否成功。采用microRNA芯片技術(shù)檢測HPH與常氧對照組大鼠肺組織中microRNA的表達(dá)譜,通過real-timePCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,最后運(yùn)用生物信息學(xué)方法對芯片結(jié)果進(jìn)行分析,以篩選可能與HPH相關(guān)的 microRNA。結(jié)果:1.芯片雜交結(jié)果經(jīng)分析后顯示,有51種microRNA在HPH模型大鼠肺組織中異常表達(dá),其中表達(dá)上調(diào)的有26個(gè)(p0.001),表達(dá)下調(diào)的25個(gè)(p0.001)。選取 5 個(gè) microRNA:miR-218,miR-26a,miR-34a,miR-98,miR-203 進(jìn)行 real-time PCR驗(yàn)證,結(jié)果示real-time PCR中microRNA的變化方向及程度與芯片高度一致;2.GO分析顯示,HPH大鼠肺組織與對照組差異性表達(dá)microRNA的高富集度的靶基因功能包括多種,涉及細(xì)胞的生長、分化、凋亡等。其中上調(diào)microRNA的高富集度靶基因功能包括鈣離子感受、DNA結(jié)合、細(xì)胞器成分等,下調(diào)microRNA的高富集度靶基因功能包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、磷酸酶活性調(diào)節(jié)等。小結(jié):與對照組相比,HPH大鼠肺組織中有26個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào),25個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào),通過GO分析HPH大鼠肺組織與常氧對照組差異性表達(dá)的microRNA的高富集度靶基因功能涉及細(xì)胞的生長、分化、凋亡。第二部分MiR-218在低氧處理的大鼠PASMC s中的表達(dá)及其對PASMCs增殖、遷移及凋亡的影響研究目的:檢測miR-218在低氧處理的大鼠PASMCs中的表達(dá)及其對PASMCs增殖、遷移及凋亡的影響。方法:首先用酶聯(lián)合消化法原代培養(yǎng)大鼠PASMCs并鑒定,用real-time PCR檢測低氧處理的PASMCs中miR-218的表達(dá)。在PASMCs中通過轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic和miR-218-Inhibitor分別過表達(dá)和抑制miR-218,轉(zhuǎn)染miR-NC作為陰性對照,分別利用CCK-8和EdU法、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式法檢測其對PASMCs增殖、遷移、凋亡的影響。結(jié)果:1.低氧24h及48h后,PASMCs中miR-218的表達(dá)均顯著低于常氧對照組(P0.01);2.相比轉(zhuǎn)染miR-NC組,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組OD值顯著降低,轉(zhuǎn)染miR-218-Inhibitor組OD值顯著升高(P0.05);EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組增殖期細(xì)胞比例明顯降低,而轉(zhuǎn)染miR-218-Inhibitor組增殖期細(xì)胞比例明顯增高(P0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組轉(zhuǎn)染24h后劃痕寬度明顯大于轉(zhuǎn)染miR-NC組,轉(zhuǎn)染miR-218-Inhibitor組24h后劃痕寬度明顯小于轉(zhuǎn)染miR-NC組(P0.05);流式細(xì)胞儀檢測三組間凋亡細(xì)胞比例,結(jié)果示:3組間細(xì)胞凋亡比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。小結(jié):MiR-218在低氧處理的PASMCs中表達(dá)降低,miR-218可以抑制PASMCs的增殖、遷移而不影響其凋亡。第三部分MiR-218通過抑制PERK在低氧性肺動脈高壓中作用研究目的:預(yù)測miR-218靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。方法:利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-218可能的靶基因,在PASMCs中轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic,轉(zhuǎn)染miR-NC作為對照,通過熒光定量PCR檢測miR-218可能的靶基因表達(dá)量進(jìn)行初步篩選;在HPH大鼠肺組織中利用Western Blot檢測miR-218可能的靶基因PERK的表達(dá);構(gòu)建pgl-promoter+PERK 3'UTR質(zhì)粒,與miR-218-Mimic、Renilla質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中,共同轉(zhuǎn)染miR-NC作為對照,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic后熒光素酶活性;在PASMCs中轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic,轉(zhuǎn)染miR-NC作為對照,利用Western Blot檢測PERK的表達(dá)。結(jié)果:1.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)合文獻(xiàn)篩選miR-218可能的靶基因?yàn)镻ERK、APAK12、TRPC1,熒光定量 PCR 結(jié)果示 PERK 在轉(zhuǎn)染 miR-218-Mimic 的 PASMCs中表達(dá)降低;2.Westem Blot結(jié)果示PERK在HPH大鼠肺組織中表達(dá)增高;3.轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組的熒光素酶活性明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC組,(P0.01)。Western Blot結(jié)果示轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic的PASMCs中PERK表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC 組。小結(jié):低氧通過抑制miR-218而激活PERK參與HPH的發(fā)生。第四部分特異性抑制miR_218靶基因PERK對HPH大鼠模型的作用研究目的:檢測miR-218靶基因PERK的特異性抑制劑GSK2656157對HPH大鼠模型的作用。方法:將18只SD大鼠隨機(jī)分為常氧對照組(N-control)、低氧對照組(H-control)、低氧干預(yù)組(H+PERK Inhibitor),三組大鼠分別經(jīng)過常氧飼養(yǎng)21天、低氧飼養(yǎng)21天、低氧飼養(yǎng)21天+ 口服PERK抑制劑GSK2656157bid21天后,經(jīng)頸外靜脈插管測RVSP,留取心臟組織計(jì)算RVHI,肺組織經(jīng)福爾馬林固定后,常規(guī)石蠟包埋,HE染色、EVG染色、α-SMA免疫組化,顯微鏡下觀察肺血管重塑情況,計(jì)算肺血管重塑指標(biāo)WT%及肌型動脈百分比。結(jié)果:1.H-control 組 RVSP 明顯高于 N-control 組(38.56±2.67 VS 26.20±1.85,P0.05),H+PERK Inhibitor 組 RVSP 明顯低于 H-control 組(38.56±2.67 VS 31.05±2.05,P0.05)。H-control 組 RVHI 明顯高于 N-control 組(0.26±0.02 VS 0.4±0.02,P0.05),H+PERK Inhibitor 組 RVHI 明顯低于 H-control 組(0.4±0.02 VS 0.31 ±0.02,P0.05);2.HE染色,與N-control組相比,H-control組肺小血管中膜平滑肌層明顯增厚,管腔狹窄,管周炎細(xì)胞浸潤,H+PERK Inhibitor組肺小血管中膜平滑肌層增厚不明顯。EVG染色,N-control組肺肌型小動脈具有內(nèi)外雙層彈力纖維及薄的肌肉層,H-control肺肌型動脈中膜平滑肌層顯著增厚,且外層彈力纖維結(jié)構(gòu)顯示不清,H+PERK Inhibitor組肺肌型動脈厚度較H-control組明顯回落,外層彈力纖維結(jié)構(gòu)可見。α-SMA免疫組化,肺肌型動脈中膜平滑肌被染成棕黃色,與N-control組相比,H-control組肺小動脈中膜厚度明顯增加,H+PERK Inhibitor組肺小動脈中膜厚度較H-control組明顯回落;3.H-control 組 WT%明顯高于 N-control 組(49.53±5.54%VS 20.08±3.24%,P0.01),H+PERK Inhibitor 組 WT%明顯低于 H-control 組(32.47±4.05%VS 49.53±5.54%,P0.05);H-control組肌型小動脈百分比明顯高于N-control組(58.09±6.24%VS 37.76±4.55%,P0.01),H+PERK Inhibitor 組肌型小動脈百分比明顯低于 H-control 組(58.09±6.24%VS 47.57±5.22%,P0.05)小結(jié):特異性抑制miR-218靶基因PERK可以有效降低低氧引起的肺動脈壓力增高,改善肺血管重塑。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 錢國清;王良興;陳嬋;黃曉穎;葉舒婷;;大鼠細(xì)小肺動脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定方法的研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2010年01期

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本文編號：1283204