本文關鍵詞：ACER2是一個新的通過促ROS產(chǎn)生而誘發(fā)自噬與凋亡的p53靶基因

  更多相關文章： ACER2 p53 DNA損傷 自噬 凋亡

【摘要】：堿性神經(jīng)酰胺酶2(Alkaline ceramidase 2,ACER2)是一個定位于高爾基體膜上的七次跨膜蛋白,在除了胎盤的各種正常組織中廣泛低表達,應對細胞刺激如DNA損傷、血清饑餓時表達明顯上調。ACER2參與鞘磷脂的代謝,能催化神經(jīng)酰胺水解生成鞘氨醇,鞘氨醇進一步磷酸化生成1磷酸鞘氨醇。ACER2可以通過控制神經(jīng)酰胺、鞘氨醇及1磷酸鞘氨醇的相對水平進而在細胞的增殖、衰老、凋亡等過程中發(fā)揮作用以控制細胞的命運。我們課題組前期的研究工作已經(jīng)鑒定了ACER2的轉錄起始位點并確定了ACER2基因的啟動子。轉錄因子結合位點分析結果顯示,ACER2基因的啟動子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潛在的轉錄因子結合位點。本研究在這一基礎上,進一步對ACER2啟動子區(qū)域重要的順式作用元件進行分析,并進一步重點研究ACER2在細胞的自噬與凋亡中作用以及發(fā)揮功能的機制。(1)ACER2啟動子區(qū)域重要轉錄因子結合位點的進一步分析采用UCSC基因組瀏覽器分析ACER2的基因組結構及基因組成,根據(jù)ENCODE組蛋白修飾數(shù)據(jù)及Chrom HMM染色體狀態(tài)分割數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ACER2基因是活躍轉錄的。采用Mat Inspector專業(yè)版與TFSEARCH軟件對ACER2的啟動子區(qū)進行轉錄因子結合位點分析,發(fā)現(xiàn)有兩個潛在的p53結合位點。這兩個潛在的p53結合位點序列在人、大鼠和小鼠中具有一定的保守性,提示其在ACER2啟動子的轉錄調控中起重要作用。(2)p53直接調節(jié)ACER2啟動子的轉錄首先,將前期構建的各ACER2啟動子報告基因系列刪除體、后期構建的ACER2-P397啟動子p53結合位點定點突變重組體以及p21、Bax的報告基因分別單獨轉染或與p53真核表達質粒共轉染入H1299細胞,結果提示,p53過表達能夠顯著提高p21、Bax的報告基因的活性以及ACER2-P397、ACER2-P676、ACER2-P800及ACER2-P1285刪除體的活性,但p53過表達對第一個p53結合位點的定點突變重組體的啟動子活性的上調作用受到顯著削弱甚至喪失,提示p53主要通過ACER2啟動子區(qū)域中的第一個潛在的p53結合位點發(fā)揮對ACER2直接轉錄激活作用。同時,將p53過表達質粒轉染入H1299細胞,定量QRT-PCR結果顯示,p53的過表達可導致細胞內源性的ACER2的m RNA水平升高。采用ADR處理H1299與A549細胞,定量QRT-PCR結果顯示,DNA損傷可使p53野生型的A549細胞內源性的ACER2的m RNA水平升高。然后將p53 si RNA轉染入A549細胞,再聯(lián)合ADR處理,定量QRT-PCR結果的顯示,si RNA介導的p53表達抑制可導致細胞內源性的ACER2 m RNA水平降低。另外,染色質免疫沉淀分析(Ch IP)結果也證實,p53可以在體內結合在ACER2啟動子核心區(qū)域的第一個潛在的p53結合位點。這些結果提示,p53可以直接調節(jié)ACER2啟動子的轉錄,ACER2是一個新的p53靶基因。(3)ACER2誘發(fā)自噬與凋亡首先,將前期構建的ACER2真核表達質粒及p53表達質粒單獨及聯(lián)合轉染入H1299細胞,wetern blot的結果分析表明,ACER2過表達能夠上調LC3-II的表達,且與p53聯(lián)合共轉能誘發(fā)更強的LC3-II的上調;透射電鏡的分析結果表明,ACER2過表達能夠誘發(fā)自噬小體的增多,且與p53聯(lián)合共轉能誘發(fā)更多的自噬小體;免疫熒光及轉染GFP-LC3質粒的實驗結果分析表明,ACER2過表達能夠誘發(fā)LC3-II斑點的增多,且與p53聯(lián)合共轉能誘發(fā)更多的LC3-II斑點;流式細胞術的實驗結果表明,ACER2過表達后H1299細胞的凋亡數(shù)量增多,且與p53聯(lián)合共轉有助于p53誘發(fā)更多的細胞凋亡。我們將ACER2表達質粒轉染入A549細胞并聯(lián)合阿霉素(ADR)刺激,western blot與流式細胞術的實驗結果表明,ACER2有助于DNA損傷誘發(fā)的細胞自噬與凋亡。然后我們將ACER2 si RNA及自噬的關鍵基因ATG5 si RNA轉染入A549細胞,再聯(lián)合ADR處理,western blot與流式細胞術的實驗結果表明,DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡需要ACER2基因。我們采用定點突變的方法構建ACER2蛋白N末端13、36個氨基酸殘基分別缺失的刪除體,將這兩個刪除體轉染入H1299細胞中,western blot的結果分析表明,刪除N末端13、36個氨基酸殘基后也能誘發(fā)自噬。這些結果提示,ACER2能誘發(fā)自噬與凋亡,且有助于p53及DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡。(4)ACER2通過產(chǎn)生ROS誘發(fā)自噬與凋亡我們采用NAC處理細胞后再將ACER2表達質粒轉染入H1299細胞,流式細胞術的結果表明,NAC能夠清除ACER2過表達產(chǎn)生的ROS;緊接著我們采用western blot及流式細胞術分別檢測自噬與凋亡,發(fā)現(xiàn)使用NAC處理后ACER2誘發(fā)的自噬與凋亡明顯減弱。然后我們將ACER2的表達質粒轉染入H1299再聯(lián)合H2O2處理,western blot及流式細胞術的結果分析表明,ACER2有助于H2O2誘發(fā)的自噬與凋亡。這些結果提示,ACER2通過產(chǎn)生ROS誘發(fā)自噬與凋亡。綜上,我們的研究不僅發(fā)現(xiàn)ACER2啟動子區(qū)域含有“明星基因”p53等重要的轉錄因子結合位點,而且進一步明確p53可以直接激活ACER2啟動子的轉錄,并且可以調控內源性ACER2的表達。轉錄激活的ACER2能夠誘發(fā)自噬與凋亡,且有助于p53及DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡。DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡需要ACER2基因的參與。明確了ACER2是通過鞘氨醇的積累產(chǎn)生更多ROS的機制誘發(fā)自噬與凋亡。本研究為進一步深入研究ACER2在細胞自噬與凋亡等過程的調控及腫瘤發(fā)生發(fā)展的調控機制和分子行為機制奠定一定的基礎,對于豐富p53在鞘磷脂的代謝調控理論以及分子腫瘤學理論也均具有重要科學意義。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R363

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 歐陽軍;;基因與長壽[J];家庭中醫(yī)藥;2006年10期

2 文輝;人到底有多少個基因?[J];百科知識;2003年11期

3 張麗華;侯振江;;p53基因在肺癌研究中的進展[J];臨床肺科雜志;2006年01期

4 程鵬,童茂榮;p53基因在肺癌的治療及預后中的價值[J];江蘇醫(yī)藥;2000年03期

5 盧薇薇;仇容;;nm23基因的研究進展[J];中國實用醫(yī)藥;2008年30期

6 張愛菊;P~(53)基因與人類腫瘤[J];醫(yī)學綜述;1998年08期

7 熊建新,吳子忠;p53基因與肺癌[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志;1999年01期

8 姚松朝;李輝;;p53基因與肺癌[J];海軍醫(yī)學;1995年01期

9 王武;盧輝山;;KAI1基因與消化道惡性腫瘤關系的研究現(xiàn)狀[J];醫(yī)學綜述;2007年07期

10 馬秀華,李翠萍,王建偉;Rb與P~(16)基因在肺癌組織中的表達及其意義[J];山東醫(yī)藥;1999年19期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張蕊;Liang Zhao;Tom Gonda;;慢病毒介導的多西環(huán)素可誘導式短發(fā)夾RNA抑制K562細胞系e-myb基因的表達[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

2 高艷紅;岳文;秦立鵬;張鵬;陳琳;裴雪濤;;人Spindlin1基因的功能初探[A];第九屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2003年

3 王衛(wèi)東;陳正堂;李德志;;腫瘤治療新策略——基因—放射治療:原理、現(xiàn)狀及展望[A];中華醫(yī)學會放射腫瘤治療學分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學術會議論文集[C];2009年

4 王今達;;21世紀生命科學飛躍發(fā)展的基礎——基因工程[A];2000年全國危重病急救醫(yī)學學術會議論文集[C];2000年

5 李寶健;許新萍;馮道榮;范欽;朱華晨;林莉;;論改良生物體遺傳性的多基因策略——Ⅰ.多基因改良策略將成為未來基因工程的主流方向[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2001年

6 王根軒;;基因表達格局與植物數(shù)量性狀的控制[A];全國植物分子生物學與生物技術學術研討會論文集[C];2000年

7 彭志宏;黃柏勝;文芳;韓仰;劉發(fā)益;鄔力祥;;Mettl9基因對U251細胞生長的影響及機制研究[A];湖南省生理科學會2013年度學術年會論文摘要匯編[C];2013年

8 付凌潔;張淑蘭;;RASSF1A基因在卵巢癌中的表達及其對增殖、凋亡的影響[A];東北三省第四屆婦產(chǎn)科學術會議論文匯編[C];2008年

9 錢偉;何云剛;賴建華;舒坤賢;譚德勇;余敏;;p53基因對mybbp1a(p160)基因的正調控作用研究[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術會議論文摘要集[C];2001年

10 薛世偉;林艷麗;熊福銀;吳曉潔;周艷榮;郭虹敏;陳紅星;陳樹林;;人Nanog基因的克隆及其在CHO-K1細胞中的表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十六次學術研討會論文集[C];2010年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 全國政協(xié)委員 民盟中央委員 曹義孫;立法規(guī)范基因檢測[N];團結報;2010年

2 呂回;鳥兒會唱人會說 只緣基因太相似[N];廣東科技報;2004年

3 ;認識我們的基因[N];科技日報;2003年

4 本報記者 張麗;基因可以透視明天嗎[N];中國消費者報;2001年

5 姜海;科學家發(fā)現(xiàn)新的致盲基因[N];科技日報;2007年

6 徐陽;基因與長壽[N];光明日報;2000年

7 記者 林小春 任海軍;美國研究表明懶或許源于基因[N];新華每日電訊;2013年

8 盧菁;怕胖可就是管不住嘴,原是基因作怪[N];新華每日電訊;2008年

9 本報記者 盧雁妮;“從對生命及疾病本源的認識到基因科技造福人類”講座開講[N];黔西南日報;2014年

10 張小軍;美發(fā)現(xiàn)老鼠性別新基因[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉芳;RB94基因在非小細胞肺癌治療中的作用及機制研究[D];山東大學;2015年

2 王宗丹;遠程調控元件mbr選擇性協(xié)調BCL2和NOXA基因轉錄活性的機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2013年

3 王曉樂;水稻脆鞘基因BSH1的圖位克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

4 劉莉莉;奶牛產(chǎn)奶性狀候選功能基因VPS28的功能驗證[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2016年

5 王義濤;ACER2是一個新的通過促ROS產(chǎn)生而誘發(fā)自噬與凋亡的p53靶基因[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

6 廖傳文;WTX基因調控肝癌細胞增殖及侵襲轉移的機制研究[D];南昌大學;2016年

7 金旭;心血管內靶向定位基因遞送體系—載基因支架的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2006年

8 楊春霞;生活方式和基因多態(tài)與食道癌的關系[D];四川大學;2005年

9 吳漢林;人NIT1基因cDNA的克隆、原核表達及抗體制備[D];四川大學;2005年

10 何勇;p73基因在人肺癌中的表達及對其細胞生物學行為的影響[D];第三軍醫(yī)大學;2004年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄧小冬;ERCC1、XPF和XPG基因在法醫(yī)學年齡推斷中的初步研究[D];川北醫(yī)學院;2015年

2 張潤賢;論基因權的私權屬性及民法保護[D];東北林業(yè)大學;2015年

3 劉偉;家蠶受體酪氨酸激酶樣的孤獨受體Ror2基因功能的研究[D];蘇州大學;2015年

4 衛(wèi)姣;銅離子感應基因MAC1轉錄機理的研究[D];鄭州大學;2015年

5 楊鎮(zhèn)宇;禁食—恢復投喂條件下鰱神經(jīng)肽Y及三個瘦素相關基因的表達分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

6 周彥寬;Fam49b基因在人類細胞系中的定向敲除及其功能研究[D];浙江大學;2015年

7 劉如錦;病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ調控抗HIV-1基因APOBEC3G表達機制的初步探討[D];杭州師范大學;2015年

8 羅萌萌;HEPIS基因功能的初步研究[D];華北理工大學;2015年

9 梁一丹;應用雙熒光素酶報告載體研究上游開放閱讀框的突變對靶基因的影響[D];南方醫(yī)科大學;2015年

10 李霞;miRNA靶基因優(yōu)選及網(wǎng)絡分析[D];天津醫(yī)科大學;2015年

，

本文編號：1282696