本文關(guān)鍵詞：共聚焦顯微內(nèi)鏡在體示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞對結(jié)腸癌的靶向作用

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【摘要】：研究目的:在全世界范圍內(nèi),結(jié)腸癌(colon cancer,CC)是位列男性第四名致死性惡性腫瘤,是位列女性第三名致死性惡性腫瘤。盡管近些年抗腫瘤治療已經(jīng)取得相當(dāng)大的進(jìn)展,但是結(jié)腸癌依然是最具挑戰(zhàn)性的疾病之一。特別是,由于結(jié)腸癌是一種具有高侵襲性的腫瘤,這一特性限制了手術(shù)切除的應(yīng)用以及具有一定的耐藥性。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞,可以自我更新,對于炎癥和活躍的腫瘤組織具有很強(qiáng)的靶向性。間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為治療基因的靶向運(yùn)輸工具。但是,目前我們對于間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況了解不多。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)可以表達(dá)為II型跨膜蛋白,是腫瘤壞死因子超家族中的新成員。近期研究表明經(jīng)過修飾可以穩(wěn)定表達(dá)治療基因的間充質(zhì)干細(xì)胞,可以作為腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的靶向與呈遞的細(xì)胞運(yùn)輸工具。這種協(xié)同抗腫瘤作用,可以用于聯(lián)合抗腫瘤治療。但是,這種聯(lián)合抗腫瘤治療方法的臨床應(yīng)用受限于缺乏對表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況的有效評估。目前,雖然有幾種方法可以檢測熒光標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況。但是尚沒有一種可行的檢測方法在細(xì)胞學(xué)水平對輸注到體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤組織靶向運(yùn)動(dòng)效率進(jìn)行評估�，F(xiàn)有的影像學(xué)檢測方法雖然可以示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)遷移運(yùn)動(dòng)與評估其治療效果。但是這些檢測方法難以有效地區(qū)分存活的完整間充質(zhì)干細(xì)胞和死亡的干細(xì)胞碎片。除此之外,它們更加難以有效評估干細(xì)胞向腫瘤組織靶向運(yùn)動(dòng)的效率。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy,CLE)是近年來發(fā)明的一種新型內(nèi)鏡檢測技術(shù),能夠?qū)崟r(shí)、有效、無創(chuàng)地在體內(nèi)顯示胃腸道粘膜的組織細(xì)胞形態(tài)。共聚焦顯微內(nèi)鏡的有效放大倍率可達(dá)1000倍,使其具有細(xì)胞學(xué)水平的分辨率。此外,共聚焦激光顯微內(nèi)鏡所使用的激光激發(fā)波長為488nm,其接收波長約為505-585nm,這一特性與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的光學(xué)特性相匹配,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。在這里,我們要證明探頭式共聚焦顯微內(nèi)鏡可以用于示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)并評估間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對結(jié)腸癌的治療效果。我們研究工作的目的如下所述:(1)提取并鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。并以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為運(yùn)輸載體,以腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)基因?yàn)橹委熁?構(gòu)建抗腫瘤的靶向重組治療間充質(zhì)干細(xì)胞(TRAIL-MSC)。(2)研究使用探頭式共聚焦顯微內(nèi)鏡在體觀察表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(TRAIL-MSC)對結(jié)腸癌的歸巢作用。進(jìn)一步了解TRAIL-MSC靶向到結(jié)腸癌瘤體表面與瘤體內(nèi)部的具體分布特點(diǎn)。評估TRAIL-MSC對結(jié)腸癌的治療效果。以證實(shí)通過共聚焦顯微內(nèi)鏡(CLE)在體示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性。研究方法:第一部分:提取,鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞并構(gòu)建TRAIL-MSC1.提取并鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞來源于三至四周齡Balb/c nu/nu小鼠的骨髓并培養(yǎng)。培養(yǎng)好的所得細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下鑒定其分化潛力與細(xì)胞表面的表型。證實(shí)所提取細(xì)胞符合小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定義。2.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TRAIL基因的間充質(zhì)干細(xì)胞按照噬菌體:細(xì)胞個(gè)數(shù)為100:1的比例,用慢病毒將TRAIL基因與EGFP基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞。使這兩種基因在間充質(zhì)干細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)。3.建立小鼠結(jié)腸癌荷瘤模型使用含有10%胎牛血清,1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29。選取三至四周齡Balb/c nu/nu小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體的環(huán)境里,體重在15-20g之間。將2×1066HT29結(jié)腸癌細(xì)胞用100mlPBS重新懸浮后使用注射器注入小鼠右側(cè)背部。第二部分:體內(nèi)示蹤TRAIL-MSC對結(jié)腸癌的靶向運(yùn)動(dòng)并評估治療效果1.小動(dòng)物整體成像的研究當(dāng)結(jié)腸癌荷瘤小鼠的腫瘤直徑達(dá)到4-6mm時(shí),將5×106修飾后間充質(zhì)干細(xì)胞用100ml PBS重新懸浮后使用注射器注入小鼠尾靜脈。注射后18天內(nèi)使用小動(dòng)物整體成像儀在第1天,第3天,第5天,第7天和第10天觀察修飾后間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)遷移情況。2.共聚焦顯微內(nèi)鏡成像觀察遷移至結(jié)腸癌組織周圍的修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量可以通過探頭式共聚焦顯微內(nèi)鏡觀察到,并與結(jié)腸癌組織的免疫熒光結(jié)果和定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果相互比對。3.TRAIL-MSC抗腫瘤治療效果評估在接受修飾后間充質(zhì)干細(xì)胞注射后第18天,將小鼠處死。通過間斷觀察并記錄小鼠在這段時(shí)間腫瘤體積與質(zhì)量的變化來評估表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體與綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞對結(jié)腸癌的治療效果。研究結(jié)果:第一部分:提取,鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞并構(gòu)建TRAIL-MSC1.提取并鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞提取自三至四周齡Balb/c nu/nu小鼠的骨髓并培養(yǎng)。培養(yǎng)好的原代干細(xì)胞在特定適宜的條件下能成功地被誘導(dǎo)分化為骨組織細(xì)胞、脂肪組織細(xì)胞和軟骨組織細(xì)胞。此外,間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞鑒定結(jié)果為:表達(dá)CD29(+),CD44(+)和CD90(+),不表達(dá)CD34(-)和CD45(-)。上述表型符合小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)。2.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TRAIL基因的間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測到使用慢病毒同時(shí)轉(zhuǎn)染腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽性率是81.6%± 3.1(P0.05,樣本數(shù)量=3)。同時(shí),只轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽性率是84.6%士1.0(P0.05,樣本數(shù)量=3)。使用熒光顯微鏡與共聚焦顯微內(nèi)鏡在體外觀察實(shí)驗(yàn)組TRAIL-MSC和對照組為單純表達(dá)綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞(EGFP-MSC)。3.建立小鼠結(jié)腸癌荷瘤模型接受結(jié)腸癌細(xì)胞HT29注射大約2-4周后,荷瘤小鼠會形成直徑大約4-6mm大小的瘤體,這表示結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型造模成功。第二部分:體內(nèi)示蹤TRAIL-MSC對結(jié)腸癌的靶向運(yùn)動(dòng)并評估治療效果。1.小動(dòng)物整體成像的研究在使用熒光成像儀觀察到的結(jié)果中,我們證實(shí)相較于未修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞,修飾后的間充質(zhì)干細(xì)胞隨著時(shí)間的推移,在小鼠體內(nèi)向腫瘤組織具有明顯的遷移趨勢。在實(shí)驗(yàn)組,大約接受尾靜脈注射10天后,TRAIL-MSC靶向遷移到結(jié)腸癌組織周圍。對照組單純轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的EGFP-MSC靶向運(yùn)動(dòng)趨勢與TRAIL-MSC相似。2.共聚焦顯微內(nèi)鏡成像觀察使用探頭式共聚焦顯微內(nèi)鏡示蹤成像表明,相較于對照組,修飾后的間質(zhì)干細(xì)胞靶向到結(jié)腸癌組織周圍分布明顯。這一結(jié)果與結(jié)腸癌組織的免疫熒光結(jié)果和定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果相互驗(yàn)證一致。在產(chǎn)生抑制結(jié)腸癌瘤體生長作用的實(shí)驗(yàn)組可以觀察到有TRAIL-MSC靶向運(yùn)動(dòng)到結(jié)腸癌瘤體組織周圍。而在未產(chǎn)生腫瘤抑制作用的對照組中均未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的熒光信號。3.TRAIL-MSC抗腫瘤治療效果評估在接受尾靜脈注射修飾間充質(zhì)干細(xì)胞靶向到結(jié)腸癌組織后,檢測到結(jié)腸腫瘤表面比結(jié)腸腫瘤內(nèi)部細(xì)胞熒光信號更強(qiáng)(P0.05,樣本數(shù)量=5)。相較于對照組(接受生理鹽水,未修飾間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射)小鼠,治療組小鼠的腫瘤體積與質(zhì)量均更小(P0.05,樣本數(shù)量=5)。研究結(jié)論:我們從Balb/c nu/nu小鼠體內(nèi)提取了原代間充質(zhì)干細(xì)胞并對其進(jìn)行了分化潛能檢測和免疫表型的鑒定。隨后我們使用攜帶有EGFP和TRAIL基因的慢病毒將目的基因轉(zhuǎn)入間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi),使其共同穩(wěn)定表達(dá),構(gòu)建出重組治療干細(xì)胞(TRAIL-MSC)。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡作為一種能夠在活體內(nèi)有效示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞移植后向腫瘤組織靶向運(yùn)動(dòng)的新型工具,在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中均具有良好的應(yīng)用前景。這種可在臨床應(yīng)用,有效,無創(chuàng)性的示蹤技術(shù)能夠針對患者個(gè)體化的干細(xì)胞治療提供有力支持。研究意義:本研究利用從小鼠骨髓提取的間充質(zhì)干細(xì)胞,把攜帶有EGFP和TRAIL基因的慢病毒與干細(xì)胞共培養(yǎng),將目的基因轉(zhuǎn)入間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi),并使目的基因在干細(xì)胞共同穩(wěn)定表達(dá),構(gòu)建出重組治療干細(xì)胞(TRAIL-MSC)。此外,本實(shí)驗(yàn)首次使用內(nèi)鏡設(shè)備對重組治療干細(xì)胞(TRAIL-MSC)進(jìn)行體內(nèi)示蹤研究,并在細(xì)胞學(xué)水平上對干細(xì)胞在體內(nèi)的靶向運(yùn)動(dòng)分布及對應(yīng)產(chǎn)生的治療效果進(jìn)行評估。與傳統(tǒng)的影像學(xué)示蹤方法相對比,共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢測技術(shù)不會受到死亡干細(xì)胞碎片的干擾,能夠有效區(qū)分活的完整間充質(zhì)干細(xì)胞。這一研究結(jié)果表明共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在活體示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞對結(jié)腸癌瘤體的靶向運(yùn)動(dòng)及分布具有明顯的優(yōu)越性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 曾紅梅;陳萬青;;中國癌癥流行病學(xué)與防治研究現(xiàn)狀[J];化學(xué)進(jìn)展;2013年09期

2 萬德森;;結(jié)直腸癌流行趨勢及其對策[J];癌癥;2009年09期

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本文編號：1282437