本文關(guān)鍵詞：miR-27a-3p調(diào)控內(nèi)皮細胞功能參與主動脈夾層血管重構(gòu)的機制研究

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【摘要】：第一部分主動脈夾層miR-27a-3p的差異表達與分布目的觀察miR-27a-3p在人主動脈組織中的表達與分布情況,初步探討miR-27a-3p與主動脈夾層的相關(guān)性。方法1、通過qRT-PCR對人主動脈組織樣本中miR-27a-3p、miR-27b、miR-217、miR-183、miR-20、miR-24的含量進行檢測;2、免疫熒光原位雜交觀察miR-27a-3p在人主動脈組織中的含量與分布,分析內(nèi)皮細胞與miR-27a-3p共定位情況。結(jié)果1、與正常人主動脈組織相比,主動脈夾層組織樣本中miR-27a-3p含量顯著降低(P0.05),其余五種miRNA含量無顯著改變;2、miR-27a-3p在人主動脈組織樣本中主要與內(nèi)皮細胞共定位分布在內(nèi)膜層,主動脈夾層組織樣本中miR-27a-3p的含量與內(nèi)皮細胞的數(shù)量均顯著低于正常人主動脈組織(P0.05)。結(jié)論主動脈夾層患者主動脈管壁組織中miR-27a-3p顯著降低,同時伴有內(nèi)皮細胞含量的減少,提示miR-27a-3p可能通過調(diào)控內(nèi)皮細胞功能參與主動脈夾層病理過程。第二部分miR-27a-3p調(diào)控HUVEC功能及機制研究目的探討miR-27a-3p對人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能的調(diào)控,篩選miR-27a-3p調(diào)控的具體靶標與通路,明確miR-27a-3p的調(diào)控機制。方法1、構(gòu)建干預HUVEC中miR-27a-3p的慢病毒并通過q RT-PCR與Western blotting檢測其干預效果,并通過CCK-8與流式細胞儀檢測HUVEC增殖與凋亡功能;2、蛋白芯片檢測干預HUVEC中miR-27a-3p后與凋亡功能相關(guān)的蛋白含量變化特征,生物信息學分析初步篩選miR-27a-3p調(diào)控靶標與通路。雙螢光素酶報告明確miR-27a-3p對FADD的直接調(diào)控作用,并通過q RT-PCR與Western blotting檢測FADD及其他相關(guān)蛋白含量;3、利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建干預FADD的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,同時干預HUVEC中的miR-27a-3p與FADD并用流式細胞儀檢測HUVEC凋亡功能改變結(jié)果1、miR-27a-3p干預慢病毒對HUVEC干預效果明確,下調(diào)miR-27a-3p顯著促進HUVEC凋亡功能,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制HUVEC凋亡功能(P0.05),而干預miR-27a-3p后對HUVEC增殖功能未觀察到顯著影響。2、蛋白芯片發(fā)現(xiàn)與凋亡通路密切相關(guān)的Caspase8、Caspase3、IGFBP-6、IGFBP-4、bcl-2、bax、TNF-alpha、IGF-II蛋白在下調(diào)miR-27a-3p組中有顯著差異(P0.05)。雙螢光素酶報告明確在凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白FADD是miR-27a-3p直接調(diào)控的靶蛋白,q RT-PCR實驗結(jié)果表明,下調(diào)miR-27a-3p能顯著提高HUVEC中FADD的表達,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制HUVEC中FADD表達(P0.05)。Western blotting實驗結(jié)果表明,下調(diào)miR-27a-3p的HUVEC中,FADD、Caspase8以及Caspase3均明顯高表達,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制FADD、Caspase8以及Caspase3的表達(P0.05)3、相對于加入si RNA NC的對照組,下調(diào)HUVEC的miR-27a-3p組中加入FADD si RNA后能抑制其對凋亡的促進作用(P0.05)。結(jié)論miR-27a-3p直接抑制FADD的表達影響凋亡通路的功能進而抑制HUVEC的凋亡功能。第三部分miR-27a-3p調(diào)控HUVEC與HASMC相互作用及機制研究目的觀察miR-27a-3p在HUVEC與HASMC相互作用中扮演的重要角色。方法利用Transwell板構(gòu)建非接觸性HUVEC與HASMC共培養(yǎng)模型,利用慢病毒干預HUVEC中的miR-27a-3p并進行共培養(yǎng),通過流式細胞儀檢測HASMC的凋亡情況,劃痕實驗與Transwell遷移實驗檢測HASMC遷移能力。通過蛋白芯片篩選共培養(yǎng)模型的上清液中與遷移功能相關(guān)的蛋白變化,挑選差異顯著的GDF8與MMP20并通過ELISA實驗驗證其表達差異。結(jié)果1、干預HUVEC中的miR-27a-3p并與HASMC共培養(yǎng)后,劃痕實驗與Trasnwell遷移實驗均發(fā)現(xiàn)下調(diào)HUVEC miR-27a-3p組能顯著促進HASMC的遷移,而上調(diào)HUVEC miR-27a-3p則起到相反的效果(P0.05)。流式細胞儀檢測到各組之間HASMC凋亡功能的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);2、蛋白芯片以1.2倍差異為閾值檢測共培養(yǎng)模型上清液中差異蛋白,發(fā)現(xiàn)73個差異蛋白,進一步通過生物信息學分析并通過ELISA實驗明確下調(diào)HUVEC miR-27a-3p組中GDF8表達顯著增高而MMP20表達顯著降低,上調(diào)HUVEC miR-27a-3p組中GDF8表達顯著降低而MMP20表達顯著升高(P0.05)。結(jié)論miR-27a-3p通過抑制HUVEC分泌GDF8同時促進HUVEC分泌MMP20抑制HASMC的遷移。第四部分miR-27a-3p影響主動脈夾層發(fā)生及血管重構(gòu)的效果與機制目的觀察miR-27a-3p對主動脈夾層的發(fā)生與血管重構(gòu)的保護作用與機制。方法1、β-氨基丙腈結(jié)合血管緊張素II成功構(gòu)建小鼠主動脈夾層模型,通過尾靜脈注射體內(nèi)干預miR-27a-3p后,q RT-PCR與Western blotting檢測干預效果以及FADD、Caspase3、Caspase8、GDF8、MMP20的含量。同時通過主動脈大體形態(tài)及HE染色分析各組之間夾層發(fā)生率的差異以及主動脈形態(tài)學改變;2、TUNEL法結(jié)合CD31免疫熒光染色原位觀察小鼠主動脈切片中內(nèi)膜層內(nèi)皮細胞凋亡情況,同時,利用免疫熒光進一步明確GDF8與MMP20在主動脈組織中的表達量與分布情況;3、利用EVG與MASSON染色分別觀察主動脈中膜彈力纖維與膠原纖維在各組之間含量的變化。結(jié)果1、造模組造模成功率為63.3%,下調(diào)miR-27a-3p顯著提高夾層造模成功率(93.3%),上調(diào)miR-27a-3p抑制夾層成功率至13.3%。分析HE染色切片發(fā)現(xiàn),造模組的主動脈中膜厚度顯著低于空白對照組,miR-27a-3p下調(diào)組中膜厚度與中膜管腔直徑比顯著低于其對照組,而miR-27a-3p上調(diào)組中膜厚度與中膜管腔直徑比顯著高于其對照組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。下調(diào)miR-27a-3p在m RNA與蛋白水平均顯著上調(diào)FADD的表達,上調(diào)則有顯著的抑制作用。下調(diào)miR-27a-3p在蛋白水平顯著促進Caspase3與Caspase8表達,上調(diào)miR-27a-3p顯著抑制二者的表達(P0.05)。雖然在m RNA水平中也觀察到下調(diào)miR-27a-3p對Caspase3與Caspase8表達的促進作用(P0.05),但是上調(diào)miR-27a-3p則沒有顯著的調(diào)控效應,GDF8與MMP20的含量在m RNA水平也沒有顯著差異;2、下調(diào)miR-27a-3p能顯著促進小鼠主動脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細胞的凋亡,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制小鼠主動脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細胞的凋亡(P0.05)。同時,相比于空白對照組,造模組小鼠主動脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細胞的凋亡雖然有所增多,但是并未發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05)。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模組中GDF8顯著多于空白對照組(P0.05),下調(diào)miR-27a-3p能顯著促進GDF8的表達(P0.05),且GDF8主要表達在小鼠主動脈的中膜,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制GDF8的表達(P0.05),而與造模組相比,下調(diào)miR-27a-3p進一步促進GDF8的表達,上調(diào)則進一步抑制其表達(P0.05)。MMP20在下調(diào)miR-27a-3p組與造模組中顯著下調(diào),而上調(diào)miR-27a-3p則促進MMP20的表達(P0.05)。3、造模組中彈力纖維與膠原與空白對照組相比均顯著降低(P0.05)。下調(diào)miR-27a-3p組的彈力纖維與膠原不僅相比其陰性對照組顯著降低,與造模組相比也顯著降低,而上調(diào)miR-27a-3p組則呈現(xiàn)相反的特征(P0.05)。結(jié)論miR-27a-3p通過抑制內(nèi)皮細胞的凋亡,減少中膜層彈力纖維與膠原纖維的降解從而影響主動脈血管重構(gòu)進而在主動脈夾層發(fā)生發(fā)展過程中具有保護作用。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R543.1

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