本文關(guān)鍵詞：miR-27a-3p調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能參與主動(dòng)脈夾層血管重構(gòu)的機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分主動(dòng)脈夾層miR-27a-3p的差異表達(dá)與分布目的觀察miR-27a-3p在人主動(dòng)脈組織中的表達(dá)與分布情況,初步探討miR-27a-3p與主動(dòng)脈夾層的相關(guān)性。方法1、通過(guò)qRT-PCR對(duì)人主動(dòng)脈組織樣本中miR-27a-3p、miR-27b、miR-217、miR-183、miR-20、miR-24的含量進(jìn)行檢測(cè);2、免疫熒光原位雜交觀察miR-27a-3p在人主動(dòng)脈組織中的含量與分布,分析內(nèi)皮細(xì)胞與miR-27a-3p共定位情況。結(jié)果1、與正常人主動(dòng)脈組織相比,主動(dòng)脈夾層組織樣本中miR-27a-3p含量顯著降低(P0.05),其余五種miRNA含量無(wú)顯著改變;2、miR-27a-3p在人主動(dòng)脈組織樣本中主要與內(nèi)皮細(xì)胞共定位分布在內(nèi)膜層,主動(dòng)脈夾層組織樣本中miR-27a-3p的含量與內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量均顯著低于正常人主動(dòng)脈組織(P0.05)。結(jié)論主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈管壁組織中miR-27a-3p顯著降低,同時(shí)伴有內(nèi)皮細(xì)胞含量的減少,提示miR-27a-3p可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能參與主動(dòng)脈夾層病理過(guò)程。第二部分miR-27a-3p調(diào)控HUVEC功能及機(jī)制研究目的探討miR-27a-3p對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控,篩選miR-27a-3p調(diào)控的具體靶標(biāo)與通路,明確miR-27a-3p的調(diào)控機(jī)制。方法1、構(gòu)建干預(yù)HUVEC中miR-27a-3p的慢病毒并通過(guò)q RT-PCR與Western blotting檢測(cè)其干預(yù)效果,并通過(guò)CCK-8與流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC增殖與凋亡功能;2、蛋白芯片檢測(cè)干預(yù)HUVEC中miR-27a-3p后與凋亡功能相關(guān)的蛋白含量變化特征,生物信息學(xué)分析初步篩選miR-27a-3p調(diào)控靶標(biāo)與通路。雙螢光素酶報(bào)告明確miR-27a-3p對(duì)FADD的直接調(diào)控作用,并通過(guò)q RT-PCR與Western blotting檢測(cè)FADD及其他相關(guān)蛋白含量;3、利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建干預(yù)FADD的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,同時(shí)干預(yù)HUVEC中的miR-27a-3p與FADD并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC凋亡功能改變結(jié)果1、miR-27a-3p干預(yù)慢病毒對(duì)HUVEC干預(yù)效果明確,下調(diào)miR-27a-3p顯著促進(jìn)HUVEC凋亡功能,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制HUVEC凋亡功能(P0.05),而干預(yù)miR-27a-3p后對(duì)HUVEC增殖功能未觀察到顯著影響。2、蛋白芯片發(fā)現(xiàn)與凋亡通路密切相關(guān)的Caspase8、Caspase3、IGFBP-6、IGFBP-4、bcl-2、bax、TNF-alpha、IGF-II蛋白在下調(diào)miR-27a-3p組中有顯著差異(P0.05)。雙螢光素酶報(bào)告明確在凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白FADD是miR-27a-3p直接調(diào)控的靶蛋白,q RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)miR-27a-3p能顯著提高HUVEC中FADD的表達(dá),上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制HUVEC中FADD表達(dá)(P0.05)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)miR-27a-3p的HUVEC中,FADD、Caspase8以及Caspase3均明顯高表達(dá),上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制FADD、Caspase8以及Caspase3的表達(dá)(P0.05)3、相對(duì)于加入si RNA NC的對(duì)照組,下調(diào)HUVEC的miR-27a-3p組中加入FADD si RNA后能抑制其對(duì)凋亡的促進(jìn)作用(P0.05)。結(jié)論miR-27a-3p直接抑制FADD的表達(dá)影響凋亡通路的功能進(jìn)而抑制HUVEC的凋亡功能。第三部分miR-27a-3p調(diào)控HUVEC與HASMC相互作用及機(jī)制研究目的觀察miR-27a-3p在HUVEC與HASMC相互作用中扮演的重要角色。方法利用Transwell板構(gòu)建非接觸性HUVEC與HASMC共培養(yǎng)模型,利用慢病毒干預(yù)HUVEC中的miR-27a-3p并進(jìn)行共培養(yǎng),通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HASMC的凋亡情況,劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HASMC遷移能力。通過(guò)蛋白芯片篩選共培養(yǎng)模型的上清液中與遷移功能相關(guān)的蛋白變化,挑選差異顯著的GDF8與MMP20并通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)差異。結(jié)果1、干預(yù)HUVEC中的miR-27a-3p并與HASMC共培養(yǎng)后,劃痕實(shí)驗(yàn)與Trasnwell遷移實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)下調(diào)HUVEC miR-27a-3p組能顯著促進(jìn)HASMC的遷移,而上調(diào)HUVEC miR-27a-3p則起到相反的效果(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到各組之間HASMC凋亡功能的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2、蛋白芯片以1.2倍差異為閾值檢測(cè)共培養(yǎng)模型上清液中差異蛋白,發(fā)現(xiàn)73個(gè)差異蛋白,進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析并通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)明確下調(diào)HUVEC miR-27a-3p組中GDF8表達(dá)顯著增高而MMP20表達(dá)顯著降低,上調(diào)HUVEC miR-27a-3p組中GDF8表達(dá)顯著降低而MMP20表達(dá)顯著升高(P0.05)。結(jié)論miR-27a-3p通過(guò)抑制HUVEC分泌GDF8同時(shí)促進(jìn)HUVEC分泌MMP20抑制HASMC的遷移。第四部分miR-27a-3p影響主動(dòng)脈夾層發(fā)生及血管重構(gòu)的效果與機(jī)制目的觀察miR-27a-3p對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生與血管重構(gòu)的保護(hù)作用與機(jī)制。方法1、β-氨基丙腈結(jié)合血管緊張素II成功構(gòu)建小鼠主動(dòng)脈夾層模型,通過(guò)尾靜脈注射體內(nèi)干預(yù)miR-27a-3p后,q RT-PCR與Western blotting檢測(cè)干預(yù)效果以及FADD、Caspase3、Caspase8、GDF8、MMP20的含量。同時(shí)通過(guò)主動(dòng)脈大體形態(tài)及HE染色分析各組之間夾層發(fā)生率的差異以及主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變;2、TUNEL法結(jié)合CD31免疫熒光染色原位觀察小鼠主動(dòng)脈切片中內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況,同時(shí),利用免疫熒光進(jìn)一步明確GDF8與MMP20在主動(dòng)脈組織中的表達(dá)量與分布情況;3、利用EVG與MASSON染色分別觀察主動(dòng)脈中膜彈力纖維與膠原纖維在各組之間含量的變化。結(jié)果1、造模組造模成功率為63.3%,下調(diào)miR-27a-3p顯著提高夾層造模成功率(93.3%),上調(diào)miR-27a-3p抑制夾層成功率至13.3%。分析HE染色切片發(fā)現(xiàn),造模組的主動(dòng)脈中膜厚度顯著低于空白對(duì)照組,miR-27a-3p下調(diào)組中膜厚度與中膜管腔直徑比顯著低于其對(duì)照組,而miR-27a-3p上調(diào)組中膜厚度與中膜管腔直徑比顯著高于其對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。下調(diào)miR-27a-3p在m RNA與蛋白水平均顯著上調(diào)FADD的表達(dá),上調(diào)則有顯著的抑制作用。下調(diào)miR-27a-3p在蛋白水平顯著促進(jìn)Caspase3與Caspase8表達(dá),上調(diào)miR-27a-3p顯著抑制二者的表達(dá)(P0.05)。雖然在m RNA水平中也觀察到下調(diào)miR-27a-3p對(duì)Caspase3與Caspase8表達(dá)的促進(jìn)作用(P0.05),但是上調(diào)miR-27a-3p則沒有顯著的調(diào)控效應(yīng),GDF8與MMP20的含量在m RNA水平也沒有顯著差異;2、下調(diào)miR-27a-3p能顯著促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(P0.05)。同時(shí),相比于空白對(duì)照組,造模組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡雖然有所增多,但是并未發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模組中GDF8顯著多于空白對(duì)照組(P0.05),下調(diào)miR-27a-3p能顯著促進(jìn)GDF8的表達(dá)(P0.05),且GDF8主要表達(dá)在小鼠主動(dòng)脈的中膜,上調(diào)miR-27a-3p則顯著抑制GDF8的表達(dá)(P0.05),而與造模組相比,下調(diào)miR-27a-3p進(jìn)一步促進(jìn)GDF8的表達(dá),上調(diào)則進(jìn)一步抑制其表達(dá)(P0.05)。MMP20在下調(diào)miR-27a-3p組與造模組中顯著下調(diào),而上調(diào)miR-27a-3p則促進(jìn)MMP20的表達(dá)(P0.05)。3、造模組中彈力纖維與膠原與空白對(duì)照組相比均顯著降低(P0.05)。下調(diào)miR-27a-3p組的彈力纖維與膠原不僅相比其陰性對(duì)照組顯著降低,與造模組相比也顯著降低,而上調(diào)miR-27a-3p組則呈現(xiàn)相反的特征(P0.05)。結(jié)論miR-27a-3p通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,減少中膜層彈力纖維與膠原纖維的降解從而影響主動(dòng)脈血管重構(gòu)進(jìn)而在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.1

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本文編號(hào)：1281548