發(fā)布時間：2017-12-12 06:12

  本文關(guān)鍵詞：23kD肝再生增強(qiáng)因子對人腎小管上皮細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：第一部分構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)23k D肝再生增強(qiáng)因子表達(dá)的人腎小管上皮細(xì)胞株目的:通過慢病毒感染人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)及嘌呤篩選的方法,構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)23k D肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration,ALR)表達(dá)的人腎小管上皮細(xì)胞株。方法:設(shè)計(jì)針對人ALR基因的si RNA干擾靶點(diǎn)序列,構(gòu)建特異性干擾人ALR表達(dá)的慢病毒sh RNA/ALR,轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)細(xì)胞。慢病毒sh RNA/control轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞作為對照。通過不同濃度嘌呤霉素對HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理,確定嘌呤霉素的篩選濃度。通過實(shí)時熒光定量PCR及免疫印跡法檢測人腎小管上皮細(xì)胞中23k D ALR的表達(dá)情況。MTS檢測HK-2細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果:序列對比確認(rèn)慢病毒中ALR si RNA寡核苷酸序列插入正確,嘌呤篩選濃度確認(rèn)為3μg/ml。實(shí)時熒光定量PCR及免疫印跡檢測顯示,與正常組及sh RNA/control對照組比較,sh RNA/ALR組細(xì)胞內(nèi)源性23k D ALR m RNA水平及蛋白表達(dá)顯著減少(P0.05)。MTS結(jié)果顯示,下調(diào)23k D ALR表達(dá)對HK-2細(xì)胞的增殖無明顯影響(P0.05)。小結(jié):成功構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)23k D ALR表達(dá)的HK-2細(xì)胞株。第二部分I/R處理對HK-2細(xì)胞23k D ALR表達(dá)及自噬水平的影響目的:了解體外缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)處理對HK-2細(xì)胞23k D ALR表達(dá)及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法:采用無糖無血清培養(yǎng)基結(jié)合缺氧復(fù)氧的方法對HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理。通過免疫印跡法檢測HK-2細(xì)胞中23k D ALR表達(dá)變化及自噬相關(guān)蛋白LC3II及p62表達(dá)變化。免疫熒光觀察HK-2細(xì)胞中LC3熒光光點(diǎn)表達(dá)情況。結(jié)果:免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)I/R處理后HK-2細(xì)胞內(nèi)23k D ALR表達(dá)升高,后逐漸降至正常。在I/R處理后3、6、12、24小時自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)均明顯升高,自噬底物蛋白p62表達(dá)下降,免疫熒光結(jié)果提示I/R處理后HK-2細(xì)胞中LC3熒光明顯增強(qiáng)。小結(jié):在I/R過程中HK-2細(xì)胞ALR表達(dá)先升高,后恢復(fù)正常。HK-2細(xì)胞自噬水平先升高,后有所降低,但仍高于正常,體外I/R模型構(gòu)建成功。第三部分下調(diào)23k D ALR表達(dá)對缺血再灌注誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬水平的影響目的:探討下調(diào)23k D ALR表達(dá)對缺血再灌注誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬水平的影響并探討其作用機(jī)制。方法:用無糖無血清培養(yǎng)基結(jié)合缺氧復(fù)氧的方法對HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理,誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞自噬。慢病毒sh RNA/ALR轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞下調(diào)了細(xì)胞中23k D ALR的表達(dá)。免疫印跡法檢測ALR及自噬相關(guān)蛋白LC3II,p62,p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,凋亡蛋白caspase-3的變化情況。激光共聚焦顯微鏡檢測HK-2細(xì)胞LC3熒光的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen,ROS)水平。電鏡檢測HK-2細(xì)胞自噬小體的形成情況。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果:免疫印跡法檢測及熒光顯微鏡結(jié)果顯示,與sh RNA/control對照組比較,sh RAN/ALR組細(xì)胞自噬水平在I/R后明顯增高,細(xì)胞內(nèi)自噬小體增多,細(xì)胞ROS水平顯著增加。與sh RNA/control組相比,sh RNA/ALR組在缺血再灌注6小時(R6H)p-AMPK升高,p-m TOR降低。予以AMPK抑制劑Compound C對HK-2細(xì)胞進(jìn)行處理后sh RNA/control組與sh RNA/ALR自噬水平下降,凋亡水平升高,在sh RNA/ALR組中更為明顯。小結(jié):23k D ALR參與了缺血再灌注誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬過程,下調(diào)HK-2細(xì)胞23k D ALR表達(dá)可以使自噬水平升高,而這一作用與23k D ALR表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致ROS水平升高,從而誘導(dǎo)AMPK-m TOR通路激活有關(guān)。而抑制自噬則使HK-2凋亡水平增加。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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