本文關鍵詞：STAT3乙�；蕾囆缘木�粒體定位及丙酮酸代謝調控

  更多相關文章： 線粒體 STAT3 乙�；� PDC E1 丙酮酸

【摘要】：研究背景信號轉導和轉錄活化因子(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT)家族蛋白表達于多類機體組織和細胞內,參與調控細胞生長、分化、凋亡、DNA損傷修復等多種生理途徑。STAT3是STAT家族的重要成員,最早被發(fā)現為癌基因[1]。STAT3可接受外界各類生長因子和細胞因子等刺激信號,調控下游目的基因表達,進而調節(jié)細胞的各項生理過程。近期研究發(fā)現STAT3也是一種多功能轉錄調節(jié)因子,其在乳腺癌、白血病及頭頸部鱗癌等多種腫瘤組織及細胞系中表現持續(xù)性活化[2],說明STAT3信號轉導通路的激活密切關聯于多類腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。STAT3調節(jié)下游靶基因的轉錄,可通過與其他調節(jié)因子形成復合物的方式,也可以通過酪氨酸位點(如Y705)的磷酸化[6],分子間酪氨酸磷酸化位點與SH2結構域的相互作用,在細胞漿部位形成同源或者異源二聚體,移位至胞核內進而調控下游靶基因的表達水平[7]。被激活的STAT3可調節(jié)下游基因的表達活性及細胞生理功能[8],例如凋亡抑制基因(Bcl-xl、Survivin、Mc-I等),細胞周期凋亡基因(Cyclin D1/D2、cMyc等),腫瘤轉移相關基因(金屬蛋白酶MMPs等)和血管內皮生成因子(VEGF等)。經細胞因子處理后,細胞漿內的信號轉導與轉錄激活因子(STAT)家族蛋白羧基末端(C末端)結構域的氨基酸殘基發(fā)生一系列翻譯后修飾變化[9],例如705位酪氨酸殘基和727位絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化,685位賴氨酸殘基發(fā)生乙酰化[7,10,11]。組蛋白乙�；D移酶CBP可介導STAT3的Lys685位點的乙�；�,該乙酰化過程是可逆的,可在Ⅰ型組蛋白去乙�；�(HDAC)和(或)Sirtuins家族特定成員的催化下發(fā)生去乙�；磻末端結構域Tyr705/Ser727磷酸化的STAT3在細胞核與目的基因啟動子結合在轉錄激活進程中起著至關重要的作用[12,13]。STAT3磷酸化激活的基因參與不同的生理進程,包括干細胞的自我更新、T細胞的分化、細胞周期和增殖等[14-17]。Lys685位點的乙�；瘜τ赟TAT3形成穩(wěn)定的二聚體、細胞生長相關基因的轉錄增強以及促進反映抑瘤素M治療的細胞循環(huán)進程具有決定性的功能,而這種二聚體對細胞因子刺激的DNA結合和轉錄調控也是必需的[7]。STAT3 Ser727位點磷酸化的發(fā)生促使細胞漿內的STAT3向線粒體轉移[18]。采用STAT3表達缺陷型PC3細胞進行檢測,表達S727A突變型STAT3的PC3細胞的生理狀態(tài)與表達野生型STAT3的PC3細胞及表達N端連接線粒體定位序列的MLS-STAT3的PC3細胞相比較,表現出電子運輸鏈(ETC)中復合物Ⅰ的活動性降低,缺氧條件下活性氧簇量(ROS)的增加。STAT3可能通過增強細胞呼吸電子傳遞鏈的活性來參與Ras(原癌基因產物)依賴性的細胞轉化[19]。推測線粒體內的STAT3可能通過與細胞呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅱ相互影響并最終提高NADH,從而增加電子呼吸鏈的活性和ATP的產生量。然而,活體實驗內最佳的ATP的產生量或氧化磷酸化作用并不需要STAT3和蛋白復合物Ⅰ/Ⅱ之間的直接相互作用[20]。故而,我們推測STAT3在線粒體代謝過程中發(fā)揮功能可能存在其他的途徑,我們以此為出發(fā)點進一步探討。磷酸化修飾主導STAT3從細胞質移位至細胞核,與DNA結合、啟動核內催化作用,去磷酸化作用終止上述信號轉導過程[21-24]。然而,STAT3在細胞質和線粒體之間通過何種方式傳導及其在線粒體中活性逆轉的機制仍然未知。有趣的是,參與去除翻譯后修飾的線粒體酶可顯著促進去乙�；痆25],從而表明乙�；揎椩诰�粒體活動中是一個重要角色。已有報道指出在線粒體內可檢測到三個去乙�；窼IRTs家庭成員SIRT3、SIRT4和SIRT5的存在[26-28]。蛋白的乙�；揎椩诩毎幱谘屦囸I/釋放狀態(tài)中往往起著至關重要的作用,因此我們推測乙�；揎椏赡茉诰�粒體內參與調控能量代謝過程。研究目的1.研究胰島素與血清生長因子誘導的STAT3乙�；揎棇�粒體內物質能量代謝途徑的調控及其作用機制。2.研究乙�；腟TAT3在線粒體內能量代謝的調控對癌細胞發(fā)生發(fā)展的影響。研究方法1.質粒和截短體的構建構建 STAT3K87R,K685R,K707R,K709R,K685/707/709R點突變質粒,STAT3(28-770),(1-738),(28-738),(1-320),(1-585),(465-770),(685-770)等截短體,確定STAT3作用功能域及位點;將酵母菌氧化酶復合物Ⅳ(Cox4)的核酸序列構建到STAT3羧基端,提高STAT3的線粒體定位。2.免疫共沉淀檢測線粒體內與STAT3相互結合相互作用的蛋白。3.轉染SiRNA分別干擾細胞內乙酰基轉移酶CBP和去乙�；窼IRT5的表達。4.蛋白Western Blot分析比較不同處理條件下,不同蛋白在細胞各組分內的表達水平及相應乙酰化修飾程度。5.免疫組化檢測STAT3 K685乙�；诎┙M織及正常癌旁組織細胞內的定位。6.質譜分析分析STAT3 C末端乙�；稽c的序列特征;檢測細胞因子誘導的STAT3乙�；稽c;檢測體外反應中SIRT3或SIRT5對包含K685乙�；碾亩蔚娜ヒ阴；�。7.檢測丙酮酸脫氫酶復合物Ⅰ(PDC E1)活性PDC E1活性檢測試劑盒(YoYongBio)采用分光光度法檢測不同處理條件下細胞的PDC E1活性。8.檢測線粒體膜電勢(MMP)水平采用碧云天(Beyotime)線粒體膜電勢檢測試劑盒(JC-1探針)(C2006)。9.胞內葡萄糖消耗水平檢測采用胞內葡萄糖檢測試劑盒(Sigma,GAGO-20)。10.油紅染色(Oil Red O Staining)著染胞內脂滴,胰島素或者血清刺激后,光學顯微鏡下直接觀測胞內脂滴的聚集狀況。11.Seahorse分析檢測不同處理條件下,胞內酸化率(Extracellular acidification rate,ECAR)和氧消耗率(Oxygen consumption rate,OCR)水平。12.α-酮戊二酸((α-KG)水平檢測采用α-KG檢測試劑盒(Sigma,MAK054)。13.檢測胞內乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)水平(1)熒光定量法:采用α-KG檢測試劑盒(Sigma,MAK039)。(2)ELISA方法:ELISA試劑盒來源于上海信帆生物科技有限公司。14.乳酸檢測采用乳酸水平檢測試劑盒(Sigma,MAK064)。15.ATP水平檢測采用ATP檢測試劑盒(Beyotime,S2006)。16.數據統計學處理one-way ANOVA分析不同樣品結果數據,p0.05(*),p0.01(**)認為有統計學意義。實驗結果1.STAT3經胰島素刺激發(fā)生乙酰化修飾,轉移進入線粒體細胞因子IL6刺激STAT3多個位點發(fā)生乙�；揎梉7,29,30],相似地,在血清饑餓的成纖維細胞中,經血清饑餓和釋放處理或胰島素刺激后,同樣檢測到了STAT3乙�；恼T導。PC3細胞蛋白的質譜分析結果顯示STATs家族中STAT1、STAT3和STAT5的C末端氨基酸序列中K685、K707和K709賴氨酸殘基與重要的磷酸化位點705位酪氨酸殘基相臨[31],為C末端區(qū)域乙酰化位點特有的序列特征。在小鼠成纖維細胞(MEFs)內,經血清饑餓釋放激活的STAT3在Y705和S727位點都發(fā)生適度的磷酸化,但胰島素處理后卻沒有明顯檢測到磷酸化的存在,但兩種處理方式都可以誘導STAT3 C末端乙�；揎椀陌l(fā)生。293T細胞內,乙�；D移酶CBP的過表達,尼克酰胺(Nicotinamide,NAM)和曲古抑菌素A(Tricostatin,TSA)均可以誘導STAT3乙�；iRNA敲除小鼠成纖維細胞內的CBP,胰島素刺激后,卻沒有明顯的STAT3乙�；F象的發(fā)生,而且胰島素刺激可以增強CBP與胰島素受體的關聯。我們分離出MEF細胞的細胞漿,細胞核和線粒體三部分,只在細胞漿和細胞核兩部分檢測到了 CBP的存在。在蛋白質合成抑制劑放線菌酮(CHX)或蛋白酶體抑制劑MG132處理的前提下,我們再用胰島素對MEFs進行處理,實驗結果表明胰島素對于STAT3的表達及穩(wěn)定性沒有明顯影響。對小鼠成纖維細胞內經血清饑餓釋放處理和胰島素刺激后各細胞組份內STAT3修飾及定位的變化進行比較,前者可以誘導STAT3同時進入線粒體和細胞核內,后者只表現出誘導STAT3線粒體的移位;只有血清饑餓釋放處理誘導S727的磷酸化,但兩者都可以誘導STAT3 K685位點乙�；陌l(fā)生。STAT3乙酰化可以發(fā)生在C末端位點,亦可發(fā)生在N端[7,32]。從胰島素處理的293T細胞內分離提純STAT3,質譜分析結果顯示胰島素誘導的STAT3乙酰化位點包括N末端結構域的K87位及C末端結構域內的K685、K707和K709。在線粒體外部,HDACs家族的HDAC6使得STAT3 K87去乙�；痆33],降低STAT3線粒體定位。血清饑餓釋放處理誘導的STAT3 Y705和S727位點的磷酸化對STAT3線粒體定位的影響不顯著。STAT3(1-738),(28-770)及(28-738)截短體都不會影響STAT3向線粒體內的移位。STAT3及各結構域截短體分別與CBP共轉染293T細胞,CBP的過表達明顯提高了STAT3WT、STAT3(1-320)和STAT3(1-585)在線粒體內的定位,但是截去N端結構域的STAT3(321-770)變化不明顯,而且STAT3 K87R與STAT3 WT相比,線粒體定位明顯降低,即使在血清刺激或者胰島素處理的條件下也沒有改觀。2.線粒體內乙酰化的STAT3與PDCE1相結合而激活PDCE1,促進丙酮酸向乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)的轉化已有報道稱,線粒體內STAT3是呼吸鏈的一個組份,可與電子傳遞鏈復合物Ⅰ/Ⅱ和GRIM-19相結合[18,19]。從HeLa細胞線粒體蛋白裂解液內分離純化STAT3,質譜分析與STAT3相關聯的組份。我們的質譜分析沒有發(fā)現上述已被報道的組份,卻驚喜地發(fā)現了新的與STAT3結合的線粒體蛋白,包括丙酮酸脫氫酶復合物Ⅰ(PDC E1)、細胞色素C(CytC)和SIRT5。在野生型MEFs細胞內,胰島素刺激加強了STAT3與PDC E1的結合,PDC E1及其余兩種丙酮酸脫氫酶復合物二氫硫辛酸轉乙酰酶(PDCE2)和二氫硫辛酸脫氫酶(PDCE3)的表達水平沒有明顯的改變。轉染293T細胞,STAT3 C末端結構域參與與PDC E1的結合。在野生型MEFs細胞內胰島素刺激增強了STAT3與PDC E1的結合,從而提高PDC E1的生物活性,促進丙酮酸轉化為乙酰輔酶A,但是在STAT3-/-MEF細胞內胰島素刺激對于丙酮酸脫氫酶活性沒有明顯影響。丙酮酸脫氫酶活性檢測試劑盒檢測到高表達Cox4-STAT3的細胞的PDC E1比高表達野生型STAT3的細胞表現出更高的生物活性。STAT3 3KR突變體抑制STAT3與PDC E1 的結合,高表達3KR(K685,K707,K709)的STAT3-/-MEFs的PDC E1的活性比高表達WT、Y705和S727A突變體的細胞明顯受到抑制。PDC E1負責丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化,胰島素刺激后,STAT3WT MEFs細胞內乙酰輔酶A的水平急劇增高;相反,STAT3-/-MEFs細胞內卻沒有明顯的變化。3.存在于線粒體內的多種去乙�；复呋疭TAT3去乙�；延袌蟮婪QSIRT5是線粒體內的去琥珀酰酶,亦是去乙�；竅9,28,34-36]。SiRNA敲除HeLa細胞內Sirtuin家族成員,篩選出針對STAT3的去乙�；�。線粒體內可檢測到SIRT3、SIRT4和SIRT5的存在,SIRT5的缺失明顯增強STAT3的乙�；潭�,SIRT3的缺失也可較小程度發(fā)揮STAT3去乙�；δ堋Ｇ贸鼳549細胞內的SIRT5,細胞漿、線粒體和細胞核三部分內STAT3乙酰化水平都相應地增強。為了進一步研究STAT3與SIRT5的結合區(qū)域,將全長STAT3、STAT3(1-130)、STAT3(465-770)分別與SIRT5共轉染293T細胞,相對于N端截短體(1-130)的微弱結合,C端截斷體(465-770)與SIRT5強烈結合。SIRT5H158Y突變體抑制了SIRT5對STAT3的去乙�；δ�。體外實驗顯示,SIRT3和SIRT5針對STAT3 K685位點均有去乙酰化的功能,但是SIRT5具有更廣泛的去乙�；δ�,SIRT3對于K707和K709位乙酰化沒有明顯抑制,故而SIRT5是我們研究的重點。線粒體內的去乙�；窼IRT3和SIRT5皆可以發(fā)揮去乙�；δ�,即使已經有報道稱兩者在線粒體能量代謝中功能相反[37-40]。4.STAT3的乙�；{控線粒體內三羧酸-電子傳遞鏈(TCA-ETC)的生物功能胰島素刺激和NAM處理都能較小幅度地提高MEFs細胞的線粒體膜電位,在STAT3-/-MEF細胞內,線粒體基礎膜電勢和胰島素刺激后的膜電勢相對于野生型MEF都明顯降低。我們選擇了在17號染色體上STAT3整個基因缺失的前列腺癌細胞株PC3作為研究對象[41]。PC3細胞內,相對于STAT3的突變體Y705F、S727A,STAT3 3KR對線粒體膜電勢的抑制作用更為顯著,說明STAT3的乙�；揎棇�粒體膜電勢的影響比磷酸化修飾更為重要[20]。過表達SIRT5可明顯抑制因CBP的過表達引起的線粒體膜電勢的提升和PDCE1活性的增強。胰島素刺激條件下,比較野生型和STAT3-/-MEF兩種細胞內ATP的合成水平,后者基礎水平ATP的合成量比較高,但是在胰島素刺激前后卻沒有明顯的變化。高表達STAT3各突變體的STAT3-/-MEF細胞的ATP合成量進行比較分析,Y705F對ATP的生成沒有明顯影響,S727A表現出較小程度的影響,但3KR明顯抑制了ATP合成的提高。與STAT3-/-MEF相比較,胰島素處理后野生型MEFs細胞內葡萄糖的水平迅速下降。Seahorse XF96胞外流量分析儀檢測胰島素處理的MEF細胞的胞外酸化率(Extracellular acidification rate,ECAR)的變化,STAT3的缺失并不影響胞內糖酵解水平,相同的實驗過程中,野生型MEF細胞經胰島素處理后氧消耗率(Oxygen consumption rate,OCR)明顯高于STAT3-/-MEF細胞。檢測胰島素處理后野生型MEF和STAT3-/-MEF細胞內α-KG的水平,我們發(fā)現STAT3對于胰島素引起的TCA循環(huán)的上調是必不可少的。分離MEF細胞內細胞漿和線粒體組份,我們發(fā)現經胰島素處理后,兩組份內的乙酰輔酶A含量都顯著增加。油紅燃料對胞內脂滴進行染色,胰島素促進野生型MEF細胞內脂滴的大量聚集,但是對STAT3-/-MEF細胞作用不明顯。與轉入STAT3WT的STAT3-/-MEF細胞相比,轉入3KR突變體的細胞沒有表現出明顯的脂滴堆積。不表達STAT3的前列腺癌PC3細胞表現出很低的PDC E1活性、線粒體膜電勢及ATP合成水平,而轉染Cox4-STAT3的PC3細胞中PDC E1活性、線粒體膜電勢及ATP合成水平都明顯升高[42]。肺腺癌細胞A549內表現出連續(xù)性高水平STAT3乙�；�,從而在大量表達STAT3的線粒體內,表現出較高水平的PDC E1活性。轉入STAT3的PC3細胞大大降低了Warburg效應,乳酸的產生量明.顯降低,葡萄糖轉化成脂肪酸量明顯升高。對從非小細胞癌和鱗狀細胞癌肺癌患者處獲取的腫瘤切片進行免疫組織化學分析,結果顯示K685位點的乙酰化廣泛分布于細胞質區(qū)域,而在正常癌旁組織中只檢測到少量K685的乙�；�。為進一步確認細胞質內K685乙酰化主要定位于線粒體,分離肺癌患者癌組織和癌旁組織細胞質和線粒體兩組份,免疫印跡實驗顯示腫瘤組織線粒體內K685乙�；黠@高于癌旁組織,相反,SIRT5的表達水平明顯低于癌旁組織,癌組織內ATP的產量也高于正常組織。結論及意義綜上所述,細胞漿內的STAT3,經過胰島素或血清內的生長因子作用激活后,可以轉移進入不同的亞細胞結構內行使不同的生物功能,包括細胞核和線粒體。然而,對于STAT3的線粒體移位及對隨后的三羧酸(TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈(ETC)調控的精確機制仍然知之甚少。在血清饑餓的細胞內驗證并觀察到了經血清釋放處理或胰島素刺激后的STAT3乙酰化過程。血清釋放處理或者胰島素刺激調動CBP乙酰化的STAT3向線粒體移位。在線粒體中,STAT3與丙酮酸脫氫酶E1(PDC-E1)結合而增強PDCE1的生物活性,隨后加速丙酮酸轉化為乙酰輔酶A,促進TCA循環(huán),提高線粒體膜電勢,促進ATP的合成。不同的去乙�；缚梢种粕鲜鯯TAT3乙酰化促進線粒體內丙酮酸代謝的過程。HDAC家族成員HDAC6使細胞漿內的STAT3 K87去乙�；�,抑制STAT3向線粒體內的移位。Sirtuin家族成員SIRT5可去乙�；疭TAT3,抑制線粒體內丙酮酸代謝的途徑。STAT3乙酰化在線粒體內促進丙酮酸代謝從而提高ATP合成的途徑,同樣適用于分析癌細胞內超常能量的產生。在肺癌A549細胞株中,線粒體內的STAT3表現出連續(xù)性的乙�；�,可以在持續(xù)性的活性狀態(tài)中維持癌細胞線粒體膜電位和ATP合成[43-45],從而為癌細胞的大量增殖提供了能量基礎。發(fā)現癌細胞的能量供給來源有助于從根本上切斷癌細胞發(fā)生發(fā)展,對于阻遏癌細胞的增殖有極其重要的理論指導意義。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2
，

本文編號：1281432