本文關(guān)鍵詞：Ⅰ.低溫條件下血小板氧化損傷機(jī)制的研究 Ⅱ.血小板冰凍保護(hù)劑DMSO的毒副作用初探

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【摘要】：血小板(platelets,PLTs)作為人體血液中的重要組分,主要功能是促進(jìn)止血和凝血,維護(hù)血管壁的完整性。血小板輸注是臨床治療血小板減少相關(guān)疾病的有效措施,提供足量安全的血小板制品對(duì)臨床及戰(zhàn)傷救治意義重大。然而,目前臨床血小板供應(yīng)存在供、求矛盾,一方面是血小板保存時(shí)間短,美國(guó)食品藥品管理局(food and drug administration,FDA)規(guī)定保存期僅為5天(22℃±2℃),易過(guò)期浪費(fèi);另一方面,戰(zhàn)時(shí)、突發(fā)事件情況下血小板的需求量增大,供不應(yīng)求。因此研究血小板長(zhǎng)期保存成為輸血醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前,延長(zhǎng)血小板保存期的方法主要有:4℃冷藏保存、冰凍干燥保存和-80℃冰凍保存,但均存在血小板的低溫?fù)p傷。血小板低溫?fù)p傷機(jī)制尚不明確,Mazur提出-80℃冰凍保存損傷主要有兩大原因:“冰晶假說(shuō)”和“鹽害假說(shuō)”。冰晶假說(shuō)是指低溫保存過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,造成血小板不可逆的機(jī)械損傷;鹽害假說(shuō)是指低溫保存過(guò)程中,細(xì)胞脫水引起溶液效應(yīng)造成的損傷。針對(duì)這兩種假說(shuō)科學(xué)家們研發(fā)了多種保護(hù)劑,其中二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的使用雖然大大延長(zhǎng)了血小板的保存時(shí)間,但是保存后血小板的生物學(xué)活性與液態(tài)常溫保存血小板仍然存在較大差異,損傷機(jī)制不明確。近年來(lái)有人提出“冷應(yīng)激假說(shuō)”,該假說(shuō)認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞遭受溫度驟變時(shí),細(xì)胞會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),釋放大量的活性氧類(lèi)物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。低溫條件下血小板損傷是否與“冷應(yīng)激”存在關(guān)聯(lián)?有待進(jìn)一步探索。FDA尚未批準(zhǔn)-80℃冰凍保存的血小板運(yùn)用于臨床,一方面是因?yàn)楸鶅龊蟮难“骞δ芟陆得黠@,另一方面保護(hù)劑DMSO尚未批準(zhǔn)用于臨床輸注。毒理學(xué)研究表明,DMSO是一種微毒類(lèi)的化學(xué)試劑。大量的毒性實(shí)驗(yàn)主要圍繞口腔、皮膚和吸入三種途徑展開(kāi),而6%DMSO冰凍保存的血小板進(jìn)行靜脈輸注后,對(duì)人體血液系統(tǒng)(紅細(xì)胞、血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞)和代謝臟器的影響尚未有研究報(bào)道。針對(duì)低溫?fù)p傷問(wèn)題,本課題通過(guò)研究低溫處理后血小板是否產(chǎn)生ROS及ROS產(chǎn)生部位,確定其對(duì)血小板產(chǎn)生的氧化損傷,揭示低溫?fù)p傷過(guò)程中血小板凋亡的機(jī)制,探討ROS靶向抑制劑對(duì)冰凍血小板的保護(hù)作用;針對(duì)DMSO的毒性問(wèn)題,本課題通過(guò)研究DMSO對(duì)人體紅細(xì)胞溶血、血小板功能和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響以及DMSO對(duì)小鼠代謝臟器的毒副作用,揭示冰凍血小板輸注前去除DMSO的必要性,最終為研發(fā)血小板的低溫保護(hù)劑及推進(jìn)解凍后去除DMSO的血小板輸注提供理論基礎(chǔ)。本課題研究?jī)?nèi)容分為以下兩個(gè)部分:一、低溫條件下血小板氧化損傷機(jī)制的研究1、低溫和ROS對(duì)血小板凋亡的影響:本研究以22℃為對(duì)照組溫度,選取了4℃、0℃、-20℃、-30℃和-80℃為低溫組溫度,作用時(shí)間為2h。低溫組血小板PS外翻率增加,線粒體膜電位下降,說(shuō)明低溫誘導(dǎo)了血小板的凋亡;在過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)和叔丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)兩種ROS類(lèi)物質(zhì)作用30min后,血小板的凋亡率隨著氧化劑濃度的增加而增加。研究結(jié)果表明:低溫和ROS類(lèi)物質(zhì)均能引起血小板凋亡的增加,兩者之間是否存在著必然的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。2、低溫條件下血小板ROS的生成及主要來(lái)源:采用ROS不同抑制劑二苯基碘酰氯(diphenyleneiodonium chloride,DPI)、N-硝基-L-精氨酸甲酯(nω-nitro-l-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)、N-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine,NAC)和線粒體靶向ROS拮抗劑Mito-TEMPO作用血小板,采用DCFH-DA和線粒體ROS靶向的Mito SOXT M Red兩種熒光探針來(lái)確定低溫處理后血小板內(nèi)ROS的生成及主要來(lái)源,結(jié)果顯示低溫處理后血小板內(nèi)ROS生成呈增加趨勢(shì),相比于前三種抑制劑,線粒體ROS靶向抑制劑Mito-TEMPO能更有效地抑制ROS的產(chǎn)生,確定了ROS主要來(lái)源為線粒體。同時(shí),低溫也會(huì)導(dǎo)致ROS清除劑錳超氧化物歧化酶(manganese super oxide dimutese,Mn SOD)蛋白含量和活性降低,導(dǎo)致ROS的降解減少。3、線粒體ROS對(duì)血小板損傷的研究:通過(guò)檢測(cè)血小板膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和線粒體心磷脂過(guò)氧化程度來(lái)確定ROS對(duì)血小板產(chǎn)生的損傷,結(jié)果顯示,與22℃組相比,低溫組MDA水平升高,心磷脂過(guò)氧化程度增加;Mito-TEMPO通過(guò)降低MDA水平和心磷脂過(guò)氧化顯著抑制了血小板的氧化損傷。同時(shí),本研究還檢測(cè)到低溫組血小板的PS外翻增加、線粒體膜電位下降以及GPIbα脫落增加,Mito-TEMPO顯著抑制了血小板的凋亡和GPIbα蛋白的脫落。4、低溫引起血小板損傷機(jī)制的研究:低溫處理血小板后,尤其當(dāng)溫度低于0℃以下時(shí),血小板細(xì)胞色素C(cytochrome C,cty C)從線粒體大量釋放到胞漿內(nèi),而胞漿中的Bcl相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated protein X,Bax)也易位至線粒體,啟動(dòng)了血小板的線粒體凋亡途徑,半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)被大量激活,引起血小板凋亡事件的發(fā)生。在加入Mito-TEMPO后caspase-3的活化受到抑制,說(shuō)明線粒體來(lái)源的ROS在低溫誘導(dǎo)的血小板凋亡中起著非常重要的作用。二、血小板冰凍保護(hù)劑DMSO的毒副作用初探1、DMSO對(duì)人紅細(xì)胞的影響:本研究采用體外溶血實(shí)驗(yàn)的方法,檢測(cè)了不同濃度DMSO(0.2%,0.4%和0.6%)作用于紅細(xì)胞后,游離血紅蛋白(plasma free hemoglobin,FHb)含量的變化,結(jié)果表明隨著DMSO濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng),FHb含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì),同時(shí)檢測(cè)紅細(xì)胞的凋亡率未發(fā)現(xiàn)明顯異常,提示DMSO對(duì)紅細(xì)胞引起的損傷是小分子化合物滲透作用直接導(dǎo)致的非免疫性溶血損傷,并沒(méi)有啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。2、DMSO對(duì)人血小板的影響:通過(guò)光學(xué)法和全血電阻法檢測(cè)了DMSO對(duì)血小板聚集功能的影響,結(jié)果表明DMSO顯著抑制了ADP、凝血酶受體激活肽和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集,起始濃度分別為0.5%、0.25%和2%,當(dāng)DMSO濃度達(dá)到6%時(shí),血小板的聚集抑制率高達(dá)90%以上。同時(shí),DMSO還降低了與血小板酶促熒光反應(yīng)活性和內(nèi)源性凝血酶水平。3、DMSO對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響:0.2%,0.4%和0.6%DMSO連續(xù)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞系Eahy926細(xì)胞5d后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMSO通過(guò)阻滯G1期抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,同時(shí)DMSO還增加了Eahy926細(xì)胞的凋亡率,均呈現(xiàn)時(shí)間-量效關(guān)系。4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):6%DMSO(150μl、300μl)連續(xù)尾靜脈輸注5d,與對(duì)照組(沒(méi)有任何處理)相比,輸注DMSO的小鼠食欲不振,體重增加緩慢,但觀察小鼠的肝、腎功能及病理切片未見(jiàn)明顯異常,可能因給藥劑量小、時(shí)間短,對(duì)肝腎產(chǎn)生的毒副作用不明顯。綜上所述,低溫處理后血小板線粒體來(lái)源ROS通過(guò)線粒體凋亡途徑引起血小板凋亡增加,線粒體ROS靶向抑制劑Mito-TEMPO通過(guò)抑制ROS水平來(lái)降低血小板的PS外翻率、提高線粒體膜電位、降低血小板的氧化損傷從而起到保護(hù)血小板的作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)保護(hù)劑DMSO可引起紅細(xì)胞溶血,抑制血小板的聚集功能,通過(guò)阻滯G1期抑制血管內(nèi)皮的增殖、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。本研究揭示了血小板低溫?fù)p傷的機(jī)制,為冰凍血小板保護(hù)液配方的研制提供新的思路和理論基礎(chǔ);針對(duì)DMSO的毒性本課題組自主研發(fā)了透析式冰凍血小板處理機(jī)(專(zhuān)利號(hào):201320735032.7),利用腎透析原理在去除DMSO的同時(shí)保證血小板的功能,相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)展,最終目的是為臨床和戰(zhàn)傷救治提供安全有效的血小板制品。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R457.1

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 袁曉華;;細(xì)胞冷凍冰晶損傷和應(yīng)激損傷機(jī)理[J];生命的化學(xué);2009年04期

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本文編號(hào)：1280807