發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 23:28

  本文關(guān)鍵詞：Galectin-1在胃腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及雙氫青蒿素對其表達(dá)的影響

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【摘要】：胃癌是目前全世界最常見腫瘤之一,進(jìn)展期胃癌的五年生存率低,竟然達(dá)到了 30%。導(dǎo)致進(jìn)展期胃癌預(yù)后差的主要原因是腫瘤細(xì)胞具有極高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,腫瘤細(xì)胞容易向周圍組織及淋巴結(jié)侵襲,最終轉(zhuǎn)移至其他器官,這是一個(gè)復(fù)雜的多步生理過程。上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用,是胃癌多步驟轉(zhuǎn)移的早期事件。目前研究發(fā)現(xiàn)很多信號通路通過協(xié)同、拮抗相互交叉參與調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生過程,如Ras-MAPK、Wnt、Rho、Src、PI3K/AKT及Hedgehog通路等。半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)是一種分布在多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種器官組織中的凝集素,以單聚體或者非共價(jià)結(jié)合的同型二聚體形式分別分布在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外,與腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等過程關(guān)系密切。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)胃癌高表達(dá)Gal-1可以促進(jìn)腫瘤血管生成并且胃癌組織高表達(dá)Gal-1提示預(yù)后差。然而,Gal-1蛋白在胃癌中的具體機(jī)制不明。Hedgehog(Hh)信號通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮十分重要作用。Hh通路主要由Hh配體,膜受體Ptch、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smo和鋅指轉(zhuǎn)錄因子 Gli-1(Glioma-associated oncogenetranscription factors-1)組成。Gli-1 是級聯(lián)傳導(dǎo)的末點(diǎn),被公認(rèn)為Hh信號通路活化的關(guān)鍵因子,在基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著不可估量的作用。有研究發(fā)現(xiàn):胰腺癌中Gal-1表達(dá)通過直接影響Hh/Gli-1通路促進(jìn)胰腺癌發(fā)生發(fā)展。然而,在胃腺癌中Gal-1是否通過Hh通路引起胃腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制的研究甚少。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是一種從中草藥——青蒿中提取的倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì)衍生物,也是青蒿治療瘧疾的主要活性成分。DHA抗瘧作用明顯,是目前用于治療耐藥瘧疾、惡性瘧疾和腦型瘧疾的最有效的藥物之一。近年的大量研究結(jié)果表明,DHA可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長,主要表現(xiàn)為該單體能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期停滯、抗腫瘤血管生成和抑制EMT過程而實(shí)現(xiàn)的。盡管這一作用已經(jīng)在多種腫瘤中被研究證實(shí),但是DHA對于胃腺癌的作用及相關(guān)機(jī)制仍然未被闡明,Gal-1與DHA的抗腫瘤作用之間是否存在相互關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究主要在前期研究的基礎(chǔ),旨在探討Gal-1與EMT標(biāo)志物在胃腺癌組織中表達(dá)及之間的相互關(guān)系,構(gòu)建Gal-1過表達(dá)/干擾的慢病毒載體感染胃腺癌細(xì)胞株,研究Gal-1促進(jìn)EMT發(fā)生的分子機(jī)制,觀察DHA對胃腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及Gal-l蛋白表達(dá)、活性的影響,初步探討DHA治療胃腺癌的相關(guān)機(jī)制。本課題共分為三個(gè)部分研究內(nèi)容。第一部分Galectin-1和EMT標(biāo)志物在胃腺癌組織中的表達(dá)、相關(guān)性及臨床意義和Galectin-1在胃腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)研究目的:本部分研討Gal-1與EMT相關(guān)標(biāo)志物細(xì)胞粘附分子上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)在胃腺癌組織中的表達(dá)及之間的關(guān)系,以及它們與腫瘤臨床特征和預(yù)后之間的關(guān)系;篩選出高低表達(dá)的胃腺癌細(xì)胞作為后續(xù)細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究對象。方法:收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院手術(shù)切除的胃腺癌組織和癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本:采用免疫組化方法檢測162例胃腺癌患者的癌組織和正常組織中Gal-1蛋白、E-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的分布及表達(dá)水平。單因素分析比較Gal-1與E-cadherin、Gal-l與Vimentin蛋白的表達(dá)差異及互相之間的關(guān)系。按照胃腺癌患者的年齡、性別、原發(fā)性腫瘤的大小、組織學(xué)類型、臨床分期、有無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移將病例分組,應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析研究蛋白的表達(dá)與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。非線性相關(guān)分析兩種蛋白的關(guān)系。采用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量-PCR法檢測人胃腺癌AGS細(xì)胞、人胃腺癌MKN-45細(xì)胞、人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞、人胃腺癌MKN-74細(xì)胞和人胃腺癌MGC-803細(xì)胞中Gal-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:Gal-1和Vimentin在胃腺癌組織中高表達(dá),E-cadherin在胃腺癌組織中低表達(dá)。Gal-1在癌旁正常胃黏膜組織中低表達(dá),E-cadherin在癌旁正常胃黏膜組織中高表達(dá),vimentin在癌旁正常胃黏膜組織中低表達(dá)。Gal-1的表達(dá)水平與胃腺癌的分化程度、浸潤深度、TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);E-cadherin的表達(dá)水平與胃腺癌的分化程度、浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);Vimentin的表達(dá)強(qiáng)弱與胃腺癌的浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。胃腺癌組織中Gal-1與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);Gal-1與vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)。在人胃腺癌AGS細(xì)胞、人胃腺癌MKN-45細(xì)胞、人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞、人胃腺癌MKN-74細(xì)胞和人胃腺癌MGC-803細(xì)胞中的表達(dá),MGC-803細(xì)胞Gal-1的蛋白和mRNA水平表達(dá)最高,MKN-74中表達(dá)水平最低。結(jié)論:Gal-1蛋白和EMT標(biāo)志物蛋白在胃腺癌組織中與胃腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān);侵襲性強(qiáng)的胃腺癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞Gal-1呈高表達(dá),侵襲性弱的胃腺癌細(xì)胞MKN-74細(xì)胞Gal-1呈低表達(dá)。第二部分Galectin-1通過Hedgehog通路調(diào)控胃腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用研究目的:觀察Gal-1表達(dá)水平對胃腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的影響:并探討Gal-1誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的可能機(jī)制。方法:構(gòu)建包裝Gal-lshRNA和Gal-1過表達(dá)慢病毒載體,感染胃腺癌細(xì)胞,篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,Western blot檢測Gal-1表達(dá)水平;觀察Gal-1表達(dá)水平后細(xì)胞的形態(tài),采用Matrigel invasion實(shí)驗(yàn)檢測透過聚碳酯膜上小孔的胃腺癌細(xì)胞數(shù)評價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。應(yīng)用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞中上皮性標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)性標(biāo)志物vimentin蛋白和mRNA水平;采用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測Gal-1表達(dá)水平改變后Gli-1表達(dá)水平;利用β-lactose(Gal-l化學(xué)性競爭抑制劑)證實(shí)內(nèi)源性Gal-1通過誘導(dǎo)Gli-1表達(dá)增強(qiáng)引起EMT的發(fā)生。結(jié)果:成功構(gòu)建包裝了慢病毒載體:LV-Gall-shRNAl,LV-Gall-shRNA2,LV-Gall-shRNA3,LV-Gal-1;相應(yīng)的對照載體:LV-shRNA-Control,LV-Control。通過觀察綠色熒光表達(dá)結(jié)合抗生素篩選獲取穩(wěn)定感染的細(xì)胞系。利用Westernblot證實(shí)感染LV-shRNA-Control的MGC-803細(xì)胞,Gal-1的表達(dá)明顯下降(P0.05);感染LV-Gal-1可明顯增加Gal-1在MKN-74細(xì)胞中的表達(dá)(P0.05)。Matrigel invasion實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,與感染LV-shRNA-Control的MGC-803細(xì)胞相比,LV-Gall-shRNA3感染可顯著降低MGC-803的侵襲細(xì)胞數(shù)(P0.05),LV-Gal-1感染可明顯增加MKN-74細(xì)胞中的侵襲細(xì)胞數(shù)(P0.05)。Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明LV-Gal-1感染的MKN-74細(xì)胞的E-cadherin的表達(dá)明顯減少和Vimentin的表達(dá)明顯增加(P0.05);慢病毒shRNA3感染的MGC-803細(xì)胞中E-cadherin蛋白和Mrna表達(dá)量明顯增強(qiáng),相反Vimentin的表達(dá)明顯減少(P0.05)。我們使用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測Hh信號通路上的活化關(guān)鍵因子Gli-1,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Gal-1的表達(dá)可以明顯抑制Gli-1表達(dá),高表達(dá)Gal-1可以增強(qiáng)Gli-1表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。為了明確內(nèi)源性Gal-1對于胃腺癌細(xì)胞EMT的影響,我們使用β-lactose抑制外源性Gal-1的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用β-lactose處理組和空白對照組相比Gli-1、Vimentin蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)并且抑制了 E-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:Gal-1通過激活Hh/Gli-1信號通路誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。第三部分雙氫青蒿素對Galectin-1誘導(dǎo)的人胃腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響目的:本研究初步評估雙氫青蒿素(DHA)對胃腺癌細(xì)胞株抑制及凋亡、Gal-l表達(dá)調(diào)控的影響,探討DHA抗腫瘤作用的可能機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)胃腺癌MGC-803細(xì)胞株,利用DMSO將DHA釋成7個(gè)濃度梯度:1、2、4、8、16、32、64μM 分別處理細(xì)胞 12h、24h、48h,并設(shè)立順鉑(cis-diaminedichloroplatinum,DDP)最終濃度10μg/mL用作陽性對照組,應(yīng)用細(xì)胞MTT方法檢測不同濃度的DHA對高表達(dá)的Gal-1胃腺癌MGC-803細(xì)胞增殖抑制情況,并用SPSS軟件計(jì)算DHA作用于MGC-803細(xì)胞的50%抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50);采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測對比DHA對人胃腺癌MGC-803細(xì)胞和感染LV-Gall-shRNA的MGC-803細(xì)胞遷移能力;采用Matrigel invasion實(shí)驗(yàn)對比DHA對人胃腺癌MGC-803細(xì)胞和感染LV-Gall-shRNA的MGC-803細(xì)胞侵襲能力;采用Western blotting及qPCR檢測對比DHA對人胃腺癌MGC-803細(xì)胞和感染LV-Gall-shRNA的MGC-803細(xì)胞中Gal-1、Gli-1和上皮轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志因子E-cadherin和Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:MTT結(jié)果顯示DHA作用于人胃腺癌MGC-803細(xì)胞12h、24h、48h后的IC50值分別是 26.03μM、11.13μM、6.784μM,陽性對照組 DDP(10μg/mL)在 12h、24h、48h 時(shí)抑制細(xì)胞的活力分分別為55.29%,26.55%和19.78%。DDP(10μg/mL)的抑制細(xì)胞活力的效果等同于26μM的DHA。DHA對高表達(dá)的Gal-1胃腺癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DHA能夠明顯減緩Gal-1引起的MGC-803細(xì)胞的遷移能力;Matrigelinvasion實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DHA能夠明顯減緩Gal-1引起的MGC-803細(xì)胞的侵襲能力;Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)顯示DHA可顯著抑制人胃腺癌MGC-803細(xì)胞中Gal-1的表達(dá),并抑制Gal-1誘導(dǎo)的胃腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,即E-cadherin表達(dá)的下調(diào)和Vimentin表達(dá)的上調(diào)。結(jié)論:DHA能夠顯著抑制胃腺癌細(xì)胞的遷移,其機(jī)制可能與DHA抑制胃腺癌細(xì)胞中的Gal-1的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1280358