本文關(guān)鍵詞：核酸內(nèi)切酶Dicer1在成骨分化中的作用及其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究

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【摘要】：牙槽骨是上下頜骨包繞支持牙根的部分,是牙周組織的重要組成部分,對牙體發(fā)生、發(fā)育、萌出和穩(wěn)定支持起著至關(guān)重要的作用。牙槽骨組織結(jié)構(gòu)與身體其它部分骨骼相似,主要由礦化的骨基質(zhì)和骨細胞構(gòu)成,并按其解剖部位分為固有牙槽骨、密質(zhì)骨、松質(zhì)骨。牙槽骨內(nèi)細胞數(shù)量及類型豐富,含有如骨髓間充質(zhì)干細胞,成骨細胞,骨細胞以及破骨細胞等,因此具有良好的可塑性,是人體骨骼中改建最活躍的部分。牙槽骨在應(yīng)力作用下的骨改建是正畸治療牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ),然而在受到外傷,不良咬合力,細菌和炎癥因子持續(xù)刺激時,牙槽骨很容易吸收喪失,從而導(dǎo)致牙齒松動或脫落。由于目前關(guān)于牙槽骨吸收的治療并不理想,因而促進牙槽骨形成是牙周組織再生研究領(lǐng)域備受關(guān)注的問題。骨組織在整個生命過程中持續(xù)不斷地自我更新與修復(fù),成骨細胞主導(dǎo)的骨形成和破骨細胞主導(dǎo)的骨吸收通過互相調(diào)節(jié)和反饋維持著骨代謝平衡,這一平衡被打破會導(dǎo)致各種骨代謝疾病發(fā)生甚至功能障礙。因此成骨細胞和破骨細胞的增殖和功能分化是維系骨代謝平衡的關(guān)鍵,大量研究也證實,這個平衡受到一系列生物學(xué)因素調(diào)控。骨形成是一系列相互作用、相互誘導(dǎo)的復(fù)雜過程。骨髓中間充質(zhì)細胞在促成骨因素誘導(dǎo)下分化為成骨細胞前體細胞,前成骨細胞在趨化因素影響下遷移到骨形成位置并分化為成骨細胞,成骨細胞分化過程中通過分泌細胞外基質(zhì)蛋白和膠原蛋白形成類骨質(zhì),類骨質(zhì)中鈣鹽持續(xù)沉積使其礦化為骨質(zhì)。成骨細胞被包埋在骨陷窩中成為骨形成作用相對靜止的骨細胞,骨細胞雖然成骨效應(yīng)減弱,但在骨質(zhì)中通過分泌細胞因子影響著破骨細胞的分化和功能活性,從而調(diào)節(jié)骨代謝平衡。由此可知,成骨細胞憑借其合成分泌骨基質(zhì)蛋白和促骨基質(zhì)礦化能力,在維持骨組織穩(wěn)定性和完整性中具有重要作用。因此,研究成骨細胞增殖分化相關(guān)調(diào)控因素及其分子機制是骨代謝性疾病和骨組織工程中的研究熱點。成骨細胞來源于骨髓間充質(zhì)干細胞,成骨細胞的生長和分化過程可分為前體細胞增殖、細胞外基質(zhì)合成分泌、基質(zhì)成熟和礦化幾個階段。各種調(diào)節(jié)因素通過信號通路將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,進而調(diào)控成骨細胞各分化階段特異性基因表達。隨著成骨分化研究的日益深入,我們知道細胞成骨分化不僅受表觀遺傳、信號通路、轉(zhuǎn)錄因子和蛋白翻譯的調(diào)控,也受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。隨著微小RNA(microRNA,miRNA)研究的蓬勃發(fā)展,microRNA在成骨分化中的作用越來越受到重視。microRNA是一類長度約為20個核苷酸的小分子非編碼RNA,它廣泛存在于各類生物體中,可以通過堿基配對與靶基因mRNA識別并結(jié)合,使其蛋白質(zhì)翻譯受阻或mRNA降解,從而實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上對靶基因mRNA的調(diào)控。miRNA表達具有時間特異性和空間特異性,其靶基因可能是關(guān)鍵的生長因子、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等細胞增殖分化相關(guān)基因,因此,miRNA在生長發(fā)育,組織器官分化和疾病發(fā)生轉(zhuǎn)歸等各種生物學(xué)過程的調(diào)控中占有重要地位。大量研究也證實miRNA在調(diào)節(jié)細胞功能方面具有重要作用,如細胞增殖與分化、合成與分泌、衰老與凋亡甚至惡性細胞的遷移與侵襲等。同樣的,多項研究證明miRNA在骨骼發(fā)育及骨代謝性疾病中起著重要作用,一系列miRNA通過其具有抑制或激活成骨分化功能的靶基因,實現(xiàn)對成骨分化時間和過程的調(diào)控。雖然各個具體的miRNA在成骨分化中扮演的角色不同,但Dicer作為miRNA生成所必需的關(guān)鍵酶在成骨分化中的作用仍鮮有報道。微小RNA前體(pre-microRNA,pre-miRNA)在Dicer酶作用下生成成熟microRNA,結(jié)合至RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物,特異性識別并剪切同源mRNA靶基因,使其蛋白翻譯阻遏。因此,研究Dicer在成骨分化中的表達變化有助于我們認識成骨分化中miRNAs作為一個整體其表達的組織特異性。目的第一部分:探討成骨分化過程中Dicer及相關(guān)基因表達變化為后續(xù)實驗提供依據(jù)。第二部分:研究Dicer在成骨分化過程中表達上調(diào)的具體調(diào)控機制。第三部分:探討Dicer在細胞成骨分化中的作用并明確其作用機制。第四部分:明確miR-21a-5p/PTEN在Dicer調(diào)控細胞成骨分化中的作用及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。方法第一部分:小鼠前成骨細胞MC3T3-E1常規(guī)培養(yǎng)或成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)細胞分化,免疫熒光標(biāo)記檢測Runx2和Dicer在細胞成骨分化中的表達和細胞內(nèi)定位。成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)13天,Realtime-PCR觀察成骨相關(guān)基因Runx2,ALP,OSX,OCN,OPN,PTEN以及Dicer,pre-miRNA21和miR-21a-5p在該細胞分化過程中隨時間變化的趨勢。分別于成骨誘導(dǎo)分化2天、4天、6天提取細胞總蛋白,western-blot檢測Dicer、β-catenin、Runx2和PTEN蛋白表達變化。第二部分:分別轉(zhuǎn)染Runx2過表達質(zhì)粒和Runx2-siRNA干擾片段上調(diào)或敲低轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達,觀察Runx2表達變化對Dicer酶表達的影響。通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測Dicer啟動子區(qū)域的Runx2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。構(gòu)建含有小鼠Dicer基因啟動子片段的熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL-Dicer promoter,采用雙熒光素酶報告基因檢測分析Runx2對Dicer啟動子的調(diào)控功能活性。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測成骨分化過程中活細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Runx2與Dicer啟動子的直接結(jié)合情況。第三部分:轉(zhuǎn)染si Dicer pool片段干擾Dicer表達。觀察Dicer對MC3T3-E1細胞增殖及成骨分化能力的影響。常規(guī)連續(xù)培養(yǎng)7天,cck8法檢測Dicer干擾下調(diào)后MC3T3-E1細胞增殖能力的變化。Dicer干擾后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7-14天,堿性磷酸酶和茜素紅染色觀察成骨細胞堿性磷酸酶合成及礦化能力的變化。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)4,6,8天,磷酸苯二鈉法檢測成骨細胞合成及分泌的ALP活性。采用Realtime-PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)志基因表達差異。最后,通過western-blot明確在常規(guī)培養(yǎng)、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)以及Dicer干擾下調(diào)后成骨誘導(dǎo)分化的MC3T3-E1細胞中Dicer、Runx2、PTEN和β-catenin蛋白表達變化第四部分:采用siRNA干擾Dicer表達,并轉(zhuǎn)染miR-21a-5p mimics或加入PTEN抑制劑VO-OHpic trihydrate。通過堿性磷酸酶染色和Realtime-PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)志基因mRNA表達變化以觀察細胞成骨分化表型變化。Western-Blot檢測Dicer、PTEN以及PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵信號分子如Akt,GSK3β和β-catenin的表達及磷酸化水平變化,以探討在細胞成骨分化過程中Runx2啟動Dicer轉(zhuǎn)錄上調(diào)后對下游miRNA及其靶基因和信號通路產(chǎn)生的影響。結(jié)果第一部分:免疫熒光發(fā)現(xiàn)Dicer在成骨分化中表達增高,主要位于胞漿區(qū)。Realtime-PCR和western-blot結(jié)果可見發(fā)現(xiàn)成骨標(biāo)志基因在分化過程中的表達趨勢與文獻報道基本一致,提示MC3T3-E1細胞成骨分化誘導(dǎo)模型建立是可靠的,同時上述成骨分化標(biāo)志基因的表達趨勢結(jié)果為本研究后續(xù)實驗如選擇采樣時間點提供了依據(jù)。Dicer在成骨分化過程中表達增高,且與Runx2表達趨勢一致,提示Dicer在成骨分化過程中的表達與作用可能與Runx2相關(guān)。成骨分化過程中miR-21a-5p表達逐漸增加,而PTEN表達有所降低,提示miR-21a-5p/PTEN的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用可能參與了調(diào)節(jié)細胞成骨分化。第二部分:實驗發(fā)現(xiàn)過表達Runx2導(dǎo)致Dicer,OCN,OPN和OSX mRNA表達上調(diào),其中Dicer,OSX表達升高具有劑量依賴性;相反siRNA干擾Runx2導(dǎo)致ALP,OSX,OCN和OPN不同程度表達下調(diào)。實驗以小鼠Dicer基因從轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site,TSS)開始上游2000bp的范圍(104753952-104751952)作為待研究啟動子區(qū)。通過Jasper和Promoter 2.0 Prediction Server預(yù)測工具,在該范圍找到4個可能的Runx2結(jié)合位點,均位于Dicer基因TSS上游1500bp以內(nèi),強烈提示Runx2對Dicer轉(zhuǎn)錄的潛在調(diào)節(jié)。構(gòu)建含Dicer基因啟動子片段的p GL-Dicer promoter質(zhì)粒。將過表達質(zhì)粒p CMV-Runx2與報告基因質(zhì)粒p GL-Dicer promoter共轉(zhuǎn)染HKK293細胞和MC3T3-E1細胞,雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中Runx2可有效激活Dicer啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,且這一作用具有劑量依賴性;在MC3T3-E1細胞中siRNA干擾Runx2可抑制Dicer啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,證實了Dicer啟動子區(qū)域包含Runx2轉(zhuǎn)錄所需的結(jié)合位點并具有轉(zhuǎn)錄激活功能。最后,染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證實MC3T3-E1細胞成骨分化中,Runx2與Dicer啟動子直接結(jié)合增加,提示Runx2可以直接調(diào)控Dicer在成骨分化過程中的表達。第三部分:實驗通過si Dicer pool干擾下調(diào)成骨細胞中Dicer表達。cck8法檢測細胞增殖活性發(fā)現(xiàn)Dicer下調(diào)對細胞增殖可能有一定促進作用。堿性磷酸酶和茜素紅染色以及堿性磷酸酶活性測定,發(fā)現(xiàn)si Dicer使成骨細胞分化能力受到抑制。同時Realtime-PCR結(jié)果提示si Dicer干擾后的成骨細胞在成骨誘導(dǎo)分化1-5天中成骨相關(guān)基因ALP,OSX,Runx2,OCN及OPN表達均較對照組細胞顯著下調(diào)。Western-blot結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)si Dicer導(dǎo)致Runx2和β-catenin蛋白量降低,PTEN蛋白量增加,提示Dicer也可能直接或間接影響Runx2在成骨分化中的表達,且可能通過影響miRNA的表達影響PTEN和β-catenin參與調(diào)控成骨分化過程。第四部分:實驗發(fā)現(xiàn)在干擾Dicer基因表達的MC3T3-E1細胞中同時轉(zhuǎn)染miR21 mimics或加入PTEN抑制劑VO-OHpic,均可部分逆轉(zhuǎn)由于Dicer干擾引起的成骨分化抑制,提示miR-21a-5p可能通過靶向抑制PTEN參與調(diào)節(jié)成骨分化。Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)在成骨分化過程中Dicer,β-catenin表達升高,p-Akt和p-GSK3β磷酸化水平上調(diào),提示在成骨分化過程中Runx2啟動了Dicer表達上調(diào),隨后miR-21a-5p上調(diào)和PTEN蛋白翻譯抑制,Akt和GSK3β磷酸化依次升高,胞內(nèi)β-catenin堆積增多,轉(zhuǎn)運入核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動成骨相關(guān)基因表達。相反,當(dāng)Dicer表達被干擾下調(diào),成熟的miR-21a-5p相應(yīng)減少,PTEN蛋白表達升高使PIP3減少,Akt磷酸化受到抑制,GSK3β磷酸化水平也相應(yīng)下降,GSK3β與Axin/APC形成復(fù)合物,使β-catenin磷酸化程度提高后啟動泛素化降解,抑制細胞成骨分化,這可能是Dicer表達干擾后抑制成骨分化的機制。結(jié)論綜上所述,本課題通過體外實驗發(fā)現(xiàn):在成骨分化過程中,Runx2作為成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子通過與Dicer啟動子結(jié)合,直接調(diào)控Dicer轉(zhuǎn)錄表達。Dicer在細胞成骨分化中表達增高,并對細胞成骨分化起著正向調(diào)節(jié)作用。miR-21a-5p在成骨分化過程中表達增高,抑制其靶基因PTEN蛋白表達,使Akt和GSK3β磷酸化水平升高,GSK3β磷酸化后從Axin/APC復(fù)合體分離,使復(fù)合體對β-catenin的磷酸化作用失活,胞內(nèi)β-catenin堆積增多,轉(zhuǎn)運入核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合共同調(diào)控成骨相關(guān)基因表達。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R78

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本文編號：1278727