本文關鍵詞：MiR-802表達對肝臟胰島素敏感性和糖代謝的影響及其調節(jié)機制

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【摘要】：隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展、社會老齡化和生活方式的改變,肥胖和2型糖尿病發(fā)病率呈快速增長趨勢,已成為全球重要的公共健康問題之一,而胰島素抵抗作為動脈粥樣硬化、高脂血癥、2型糖尿病、肥胖等許多代謝性疾病的共同土壤,已成為研究的熱點。其中肝臟是機體物質代謝中心,也是胰島素作用的重要器官,肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗時會影響糖脂代謝,機體出現(xiàn)血糖升高,肝內脂質沉積,進一步加重胰島素抵抗,二者形成惡性循環(huán)。MicroRNA(又稱miRNA)是一類參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子單鏈RNA。新近研究表明miRNA與肥胖和糖尿病關系密切。Higuchi等人通過miRNA芯片方法篩選出高脂誘導的肥胖小鼠模型肝臟及內臟白色脂肪組織中miR-802的表達是上調的;與糖耐量正常的人群相比,糖尿病患者血清中miR-802表達升高,提示miR-802可能與糖代謝、胰島素抵抗有關,其具體關系和作用機制值得進一步研究。本課題首先通過HepG2細胞系構建棕櫚酸誘導的胰島素抵抗模型,觀察miR-802與肝臟胰島素抵抗及糖代謝的關系,隨后通過在該細胞模型上轉染模擬物和抑制劑分別上調和下調miR-802的表達,進一步確定miR-802對肝臟胰島素敏感性的調節(jié)作用;之后通過基因芯片對miR-802調節(jié)肝臟胰島素敏感性的潛在靶基因進行篩選;最后通過尾靜脈注射腺相關病毒實驗,在高脂飲食誘導胰島素抵抗小鼠模型上進一步明確miR-802調節(jié)肝臟胰島素敏感性及糖代謝的機制,為闡明胰島素抵抗的發(fā)病機制、尋找新的藥物靶點提供理論依據(jù)。第一部分MiR-802對棕櫚酸誘導的HepG2細胞胰島素抵抗及糖代謝的影響目的:應用棕櫚酸誘導HepG2細胞構建胰島素抵抗細胞模型,通過上調或者下調miR-802的表達,觀察葡萄糖代謝和胰島素信號通路關鍵指標的變化,明確miR-802與肝臟糖代謝及胰島素敏感性的關系。方法:在棕櫚酸培養(yǎng)的HepG2細胞中通過轉染miR-802的模擬物或者抑制物來上調或者下調肝細胞內miR-802的表達,分為以下六組:正常對照組(Con),棕櫚酸干預組(PA),棕櫚酸+miR-802模擬物組(miR-802-mimic),棕櫚酸 + 模擬物對照組(mimic-negative control,mimic-NC),棕櫚酸 + miR-802 抑制物組(miR-802-inhibitor),棕櫚酸+抑制物對照組(inhibitor-negative control,inhibitor-NC)。應用化學法測定轉染后各組細胞培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度;提取miRNA及總RNA,應用實時熒光定量PCR技術檢測miR-802的mRNA水平及胰島素信號通路IRS-2、PI3K和AKT及糖代謝G6PC和GSK-3 β的mRNA表達。應用Western blot技術檢測相關總蛋白的變化和磷酸化表達。結果:1體外構建HepG2細胞的IR模型經(jīng)PA干預24小時后HepG2細胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量PA組比正常對照組升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),提示經(jīng)PA干預后HepG2的胰島素敏感性下降,在體外實驗中成功構建了胰島素抵抗模型。2轉染HepG2細胞后各組miR-802的mRNA表達與Con組相比,PA干預組的miR-802表達升高(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義;MiR-802-mimic組,其miR-802的mRNA水平較對照mimic-NC 組升高(P0.05);而 miR-802-inhibitor 組中 miR-802 的 mRNA水平較對照inhibitor-NC組降低(P0.05)。3 MiR-802的上調/下調對胰島素信號通路中相關蛋白表達的影響3.1胰島素信號通路關鍵基因的轉錄水平測定與 Con 組相比,PA 組 HepG2 細胞 INSR、IRS-2、PI3K 和 AKT 的mRNA表達下降;上調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照組mimic-NC相比,PI3K的mRNA表達進一步下降(P0.05);下調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照組inhibitor-NC相比,PI3K的mRNA表達升高(P0.05)。無論上調或者下調HepG2細胞miR-802的表達,INSR、IRS-2和AKT的mRNA表達無明顯改變(P0.05)。3.2胰島素信號通路關鍵基因的蛋白表達的變化在PA干預組中IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達較Con組無明顯變化,但IRS-2蛋白的絲氨酸磷酸化水平升高,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平減少,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。上調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照mimic-NC組相比,miR-802組IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達無顯著性改變,但IRS-2蛋白的磷酸化水平進一步升高,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平均進一步下降;下調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照組 inhibitor-NC 組相比,miR-802-inhibitor 組 IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達仍無顯著性改變,但IRS-2蛋白的磷酸化水平降低,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平升高。4 MiR-802的上調/下調對糖代謝的影響4.1 MiR-802的上調/下調對培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的影響與Con組相比,PA干預24小時后其培養(yǎng)基中葡萄糖濃度升高(P0.05);上調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照mimic-NC組相比,miR-802組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度進一步升高(P0.05);下調HepG2細胞 miR-802 的表達后,與對照 inhibitor-NC 組相比,miR-802-inhibitor組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低(PO.05)。4.2 MiR-802的上調/下調對各組細胞葡萄糖代謝關鍵酶表達的變化與Con組相比,PA組G6PCmRNA和蛋白表達均升高(P0.05);上調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照mimic-NC組相比,G6PC的mRNA和蛋白表達進一步升高(P0.05);下調HepG2細胞miR-802的表達后,與對照inhibitor-NC組相比,G6PC無論mRNA還是蛋白表達均降低(P0.05)。第二部分MiR-802調節(jié)HepG2細胞胰島素抵抗及糖代謝的潛在機制和靶基因篩選目的:在明確miR-802對肝臟胰島素敏感性的調節(jié)作用的基礎上,進一步通過基因表達譜芯片和生物信息學方法篩選miR-802影響肝臟胰島素敏感性的潛在靶點,并通過Western-blot進行體外驗證。方法:HepG2細胞轉染同第一部分工作,取其中的棕櫚酸干預組(PA),棕櫚酸 + miR-802 模擬物組(miR-802-mimic,miR-802),棕櫚酸+模擬物對照組(mimic negative control,NC)交由上海伯豪生物技術有限公司公司進行Human Genome U133 Plus 2.0 Array型號的芯片檢測。通過對芯片數(shù)據(jù)進行差異表達分析、功能富集分析篩選miR-802過表達所影響的信號通路,進而推測miR-802調控肝臟糖代謝和胰島素敏感性的潛在機制。通過Targetscan對miR-802的靶點進行預測,同時結合芯片數(shù)據(jù)篩選出miR-802影響胰島素信號通路的靶基因,通過Westem-blot在HepG2細胞上進行驗證。結果:1轉染HepG2細胞后各組miR-802的mRNA的表達與PA干預組和對照NC組相比,過表達miR-802組,其miR-802的mRNA水平明顯升高(P0.05)。2芯片結果分析2.1主成份分析對PA組、miR-802組和NC三組樣本進行主成分分析,結果如圖3所示。在該圖中,NC組和PA組的表達譜相近,說明空載體轉染對整個體系無明顯影響;而這兩組與miR-802組在基因表達水平上有較大差異,說明miR-802的過表達從整體上影響了 HepG2細胞的基因表達。2.2差異基因篩選由于主成份分析結果顯示NC組和PA組表達譜相近,因此我們以NC組為對照,根據(jù)正文第二部分中2.3.2節(jié)的方法從miR-802組篩選差異基因,結果如圖3所示。與NC轉染組比較,miR-802轉染的HepG2細胞株中有505個基因發(fā)生了顯著上調(倍數(shù)值2.0);有104個基因受到顯著下調(倍數(shù)值2.0)。2.3 MiR-802過表達體系的功能富集分析我們將差異基因分別映射到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫,進行功能富集分析,結果如圖4所示。觀察圖4發(fā)現(xiàn),在排名前10位的信號通路中,miR-802的過表達顯著影響了磷酸肌醇信號通路和肌醇磷酸鹽代謝通路(TOP3)。芯片數(shù)據(jù)顯示,miR-802的過表達使磷酸肌醇3激酶調控亞單位2(Phosphoinositide 3 kinase regulatory subunit,PIK3R2)的表達量減少約 2倍,人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)表達升高。PIK3R2 是 PI3K 的調節(jié)亞基 2,又被稱為PI3KP85調節(jié)亞基β。而我們Western blot所用的PI3K的抗體檢測的是P85亞基的水平,因此在蛋白水平上檢測PI3KP85的表達可以代表PIK3R2的蛋白表達。PIK3R2可以促進磷酸肌醇三磷酸(Phosphoinositide 3 phosphoric acid,PIP3)的生成,而PTEN可以促進PIP3去磷酸化從而生成PIP2。因此,下調的PIK3R2和上調的PTEN可能共同抑制PIP3的生成,進而降低下游AKT的磷酸化水平,影響肝細胞的糖代謝和胰島素敏感性。此外,該通路的上游調控基因細胞因子信號抑制因子3(suppressors of cytokine signaling3,SOCS3)在 miR-802 過表達組上調了 1.9倍。SOCS3可以競爭性抑制IRS酪氨酸磷酸化,減少IRS與PI3K的調節(jié)亞單位P85的結合。因此,上調的SOCS3可能進一步抑制PI3K-AKT信號通路。同時,該通路的下游基因葡萄糖6磷酸達組增加約1.7倍,提示miR-802可能通過PI3K-AKT通路促進糖異酶催化亞基(Glucose 6 phosphatase catalytic subunit,G6PC)在 miR-802 過表生過程。該機制如圖5所示。綜上,miR-802的過表達可以使PI3K-AKT信號通路關鍵基因表達量減少,SOCS3表達量增多,從而影響肝臟糖代謝過程,進而影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性。3靶基因的預測及驗證在確定了 miR-802影響糖代謝和胰島素敏感性等相關通路的基礎上,我們對其潛在的分子機制作了進一步探索。通過Targetscan預測miR-802的靶基因,并結合表達譜芯片對預測到的靶點進行篩選,取預測為陽性且在miR-802過表達組顯著下調的基因作為miR-802的靶點,共篩選到17個候選靶基因,結果如圖7表所示。其中,肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF1B)是青年人中的成年發(fā)病型糖尿病(maturity-onset diabetes mellitus of the young,MODY)的重要致病基因,大量研究表明其與疾病的關系。根據(jù)Targetscan的預測結果,miR-802與HNF1B的mRNA的3' UTR端有大于6個理論結合位點(Fig.8)。MiR-802可以通過這些位點與HNF1B的mRNA結合,以達到抑制HNF1B轉錄的作用,從而抑制HNF1B蛋白的表達。進一步通過WB檢測該蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)miR-802的過表達使該基因下調約2倍(Fig9,Table3),提示HNF1B很可能是miR-802調控糖代謝的重要靶點。第三部分MiR-802通過HNF1B對高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟胰島素抵抗及糖代謝的調節(jié)機制目的:在高脂誘導IR小鼠模型上,通過轉染腺相關病毒(adeno-associated viral,AAV)調節(jié) miR-802 的表達,體內觀察 miR-802 的上/下調對其靶基因HNF1和PI3K-AKT信號通路的影響,同時檢測該通路上游基因和下游糖代謝通路上關鍵酶的表達,揭示miR-802-HNFlB這一信號通路體內調控胰島素抵抗和糖代謝的潛在機制。方法:5周齡C57BL/6J小鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為2組:對照組(Normal diet,ND)14 只,高脂組(high fat diet,HFD)60 只。對照組給予普通飼料D12450B喂養(yǎng),熱量組成:碳水化合物70%,蛋白質20%,脂肪10%,總熱量為385 kal/100g。高脂組給予高脂飲食D12492喂養(yǎng),熱量組成:碳水化合物20%,蛋白質20%,脂肪60%,總熱量為524 kal/100g。每日記錄攝食量,每周記錄兩次空腹體重,于高脂喂養(yǎng)12周后測空腹及進食后血糖變化。每組隨機選6只小鼠行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT),并留尾靜脈血清測胰島素水平,計算QUICKI值和葡萄糖曲線下面積(AUCglu);隨后每組隨機選擇5只小鼠,處死后留取血及肝臟標本。高脂誘導IR小鼠模型造模成功后,高脂模型組通過轉染miR-802的腺相關病毒來調節(jié)肝臟miR-802的表達,分為五組:單純高脂飲食組(High-fat diet,HFD)、高脂飲食+miR-802 過表達組(miR-802)、高脂飲食+miR-802過表達對照組(GFP)、高脂飲食+miR-802敲低組(AAV-Sponge,miR-802-SP)、高脂飲食+miR-802敲低陰性對照組(AAV-Negative Control,NC))。注射腺相關病4 周后行 IPGTT 試驗,留取空腹尾靜脈血清測胰島素水平,并計算QUICKI值和AUCglu。隨后全部處死小鼠,留取血清及肝臟標本,測定TC和TG,通過實時熒光定量PCR技術檢測各組小鼠肝臟miR-802的表達,胰島素信號通路IRS-2、PI3K 和 AKT,及 G6PC、SOCS3 的 mRNA 水平。應用 Western blot 技術檢測IRS-2和AKT總蛋白及磷酸化水平及PI3K和靶基因HNF1B蛋白表達的變化。應用試劑盒測定各組小鼠肝臟糖原含量、GK活性和PEPCK活性。HE染色觀察小鼠肝臟形態(tài)變化。結果:1高脂飲食誘導胰島素抵抗小鼠模型的建立高脂飲食喂養(yǎng)12周后,HFD組小鼠體重高于ND組(P0.05);HFD組FBG水平較ND組略升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),進食后血糖HFD組高于ND組,(P0.01);HFD組小鼠空腹血清INS、TC及TG水平高于ND組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。IPGTT結果示:HFD組15,、30'、60'血糖均較ND組升高(P0.05),HFD組AUCglu也顯著升高(P0.05)。與ND組相比,HFD組定量胰島素敏感性指數(shù)(Quantitative Insulin Sensitivity Check Index,QUICKI=1/[log(I0)+log(G0)])值明顯降低(P0.05)。2轉染腺相關病毒后各組小鼠肝臟miR-802的mRNA水平比較與ND組相比,HFD組小鼠肝臟miR-802的mRNA水平明顯升高(P0.05),轉染AAV后4周后,miR-802組肝臟miR-802的mRNA水平較對照GFP組明顯升高(P0.05);miR-802-SP組肝臟miR-802的mRNA水平較對照NC組明顯降低(P0.05);且在熒光顯微鏡下可以看到肝臟切片綠色熒光的表達,提示AAV轉染成功。3轉染腺相關病毒后胰島素敏感性相關指標的變化3.1各組小鼠一般指標的變化注射AAV使miR-802的表達量升高或者降低后,各干預組小鼠的體重及攝食量與HFD組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)。給予AAV轉染上調/下調miR-802的表達量后,miR-802組的INS和TG較對照GFP組升高;miR-802-SP組的INS和TG較對照NC組降低(P0.05);然而各干預組間血清TC水平變化無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.2各組小鼠胰島素敏感性比較IPGTT結果示:HFD組15'、30'、60'血糖均較ND組升高(P0.05),上調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802組30'血糖較對照GFP組升高(P0.05);15'、60'、120'血糖均較對照GFP組升高(P0.05)。下調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組0'、30'血糖較對照NC組降低(P0.05)。HFD組AUCglu高于ND組,而QUICKI值較ND組明顯降低(P0.05);上調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802組AUCglu高于對照GFP組,而QUICKI值較對照GFP組降低(P0.05);下調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組AUCglu較對照NC組降低,QUICKI值較對照NC組升高(P0.05)。提示高脂組小鼠發(fā)生胰島素抵抗,上調/下調肝臟miR-802表達后可影響胰島素敏感性。4 PI3K-AKT通路的變化4.1 PI3K-AKT通路上關鍵基因的mRNA表達比較與ND組相比,HFD組小鼠IRS-2、PI3K和AKT的mRNA表達下降(P0.05);上調小鼠肝臟miR-802表達后,PI3K的mRNA表達較GFP組下降(P0.05),下調小鼠肝臟miR-802表達后,PI3K的mRNA表達較NC組升高。無論上調或者下調miR-802的表達,IRS-2和AKT的mRNA表達無明顯變化。4.2 PI3K-AKT信號通路的蛋白水平變化與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟的P-IRS-2/IRS-2的比值升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值降低;上調肝臟miR-802表達后,p-IRS-2/IRS-2 的比值較對照GFP組升高,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 的比值降低,提示胰島素敏感性下降;下調肝臟miR-802表達后,p-IRS-2/IRS-2的比值較對照NC組降低,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值升高(P0.05),提示下調肝臟miR-802的表達后改善了肝臟胰島素的敏感性。5 MiR-802靶基因HNF1B蛋白表達的變化與對照ND組相比,HFD組小鼠HNF1B蛋白水平降低;上調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802組HNF1B蛋白表達較GFP組明顯降低(P0.05);下調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組HNF1B蛋白表達較NC組明顯升高;支持HNF1B是miR-802的靶基因。6肝臟糖代謝相關指標的變化6.1肝臟糖原含量的變化與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟糖原含量降低;上調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802組小鼠肝臟糖原含量較對照GFP組降低(P0.05);下調小鼠肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組小鼠肝臟糖原含量較對照NC組升高(P0.05)。6.2肝臟GK和PEPCK活性與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟GK活性降低,PEPCK活性升高;上調肝臟miR-802表達后,miR-802組小鼠肝臟GK活性較對照GFP組降低(P0.05),PEPCK活性較對照GFP組明顯升高(P0.05);下調肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組小鼠肝臟GK活性較對照NC組升高(P0.05),PEPCK活性較對照NC組明顯降低(P0.05)。提示高脂飲食時肝臟糖異生增加,糖酵解減少,上調/下調肝臟miR-802表達后可影響肝臟糖代謝。6.3各組小鼠G6PC和SOCS3的mRNA水平比較與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);上調肝臟miR-802表達后,miR-802組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平較對照GFP組升高(P0.05);下調肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平較對照NC組降低(P0.05)。7肝臟組織形態(tài)學比較ND組肝組織結構完整,肝小葉規(guī)則,肝細胞排列整齊,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,肝細胞中央有大而圓的核,細胞質均勻,未見脂滴和炎癥細胞侵潤;HFD組小鼠肝小葉結構紊亂,肝細胞腫脹,肝細胞胞漿內可見脂滴空泡,且可見小葉內及匯管區(qū)炎癥細胞侵潤;上調肝臟miR-802表達后,miR-802組可見肝小葉結構明顯紊亂,肝細胞索消失,肝細胞變大,肝細胞胞漿內可見大量圓形脂滴空泡,重者胞質疏松呈網(wǎng)狀改變,且小葉內炎細胞侵潤程度較對照GFP組增加。上調肝臟miR-802表達后,miR-802-SP組小鼠肝臟可見肝細胞體積較對照NC組變小,胞漿內脂滴減少,小葉內炎細胞侵潤程度較對照組有所緩解。結論:1在細胞和動物水平驗證了IR模型中miR-802的表達升高,并且與胰島素抵抗和糖代謝異常有關。。2在IR細胞模型上,通過表達譜芯片和靶基因預測軟件篩選出miR-802的潛在靶點HNF1B,進一步的功能富集分析提示miR-802可能通過該靶點調節(jié)PI3K-AKT信號通路,進而影響肝臟胰島素敏感性和糖代謝。3在高脂誘導IR的小鼠模型上進一步驗證了miR-802-HNF1B這一通路對PI3K-AKT的調節(jié)作用,從動物水平說明了miR-802在調節(jié)肝臟胰島素敏感性和糖代謝方面的重要意義。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1278449