本文關(guān)鍵詞：MiR-802表達(dá)對肝臟胰島素敏感性和糖代謝的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制

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【摘要】：隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、社會老齡化和生活方式的改變,肥胖和2型糖尿病發(fā)病率呈快速增長趨勢,已成為全球重要的公共健康問題之一,而胰島素抵抗作為動脈粥樣硬化、高脂血癥、2型糖尿病、肥胖等許多代謝性疾病的共同土壤,已成為研究的熱點(diǎn)。其中肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝中心,也是胰島素作用的重要器官,肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗時會影響糖脂代謝,機(jī)體出現(xiàn)血糖升高,肝內(nèi)脂質(zhì)沉積,進(jìn)一步加重胰島素抵抗,二者形成惡性循環(huán)。MicroRNA(又稱miRNA)是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子單鏈RNA。新近研究表明miRNA與肥胖和糖尿病關(guān)系密切。Higuchi等人通過miRNA芯片方法篩選出高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型肝臟及內(nèi)臟白色脂肪組織中miR-802的表達(dá)是上調(diào)的;與糖耐量正常的人群相比,糖尿病患者血清中miR-802表達(dá)升高,提示miR-802可能與糖代謝、胰島素抵抗有關(guān),其具體關(guān)系和作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。本課題首先通過HepG2細(xì)胞系構(gòu)建棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型,觀察miR-802與肝臟胰島素抵抗及糖代謝的關(guān)系,隨后通過在該細(xì)胞模型上轉(zhuǎn)染模擬物和抑制劑分別上調(diào)和下調(diào)miR-802的表達(dá),進(jìn)一步確定miR-802對肝臟胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用;之后通過基因芯片對miR-802調(diào)節(jié)肝臟胰島素敏感性的潛在靶基因進(jìn)行篩選;最后通過尾靜脈注射腺相關(guān)病毒實(shí)驗(yàn),在高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型上進(jìn)一步明確miR-802調(diào)節(jié)肝臟胰島素敏感性及糖代謝的機(jī)制,為闡明胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制、尋找新的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。第一部分MiR-802對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗及糖代謝的影響目的:應(yīng)用棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型,通過上調(diào)或者下調(diào)miR-802的表達(dá),觀察葡萄糖代謝和胰島素信號通路關(guān)鍵指標(biāo)的變化,明確miR-802與肝臟糖代謝及胰島素敏感性的關(guān)系。方法:在棕櫚酸培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染miR-802的模擬物或者抑制物來上調(diào)或者下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)miR-802的表達(dá),分為以下六組:正常對照組(Con),棕櫚酸干預(yù)組(PA),棕櫚酸+miR-802模擬物組(miR-802-mimic),棕櫚酸 + 模擬物對照組(mimic-negative control,mimic-NC),棕櫚酸 + miR-802 抑制物組(miR-802-inhibitor),棕櫚酸+抑制物對照組(inhibitor-negative control,inhibitor-NC)。應(yīng)用化學(xué)法測定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度;提取miRNA及總RNA,應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-802的mRNA水平及胰島素信號通路IRS-2、PI3K和AKT及糖代謝G6PC和GSK-3 β的mRNA表達(dá)。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測相關(guān)總蛋白的變化和磷酸化表達(dá)。結(jié)果:1體外構(gòu)建HepG2細(xì)胞的IR模型經(jīng)PA干預(yù)24小時后HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量PA組比正常對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示經(jīng)PA干預(yù)后HepG2的胰島素敏感性下降,在體外實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了胰島素抵抗模型。2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后各組miR-802的mRNA表達(dá)與Con組相比,PA干預(yù)組的miR-802表達(dá)升高(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;MiR-802-mimic組,其miR-802的mRNA水平較對照mimic-NC 組升高(P0.05);而 miR-802-inhibitor 組中 miR-802 的 mRNA水平較對照inhibitor-NC組降低(P0.05)。3 MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對胰島素信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響3.1胰島素信號通路關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平測定與 Con 組相比,PA 組 HepG2 細(xì)胞 INSR、IRS-2、PI3K 和 AKT 的mRNA表達(dá)下降;上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照組mimic-NC相比,PI3K的mRNA表達(dá)進(jìn)一步下降(P0.05);下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照組inhibitor-NC相比,PI3K的mRNA表達(dá)升高(P0.05)。無論上調(diào)或者下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá),INSR、IRS-2和AKT的mRNA表達(dá)無明顯改變(P0.05)。3.2胰島素信號通路關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)的變化在PA干預(yù)組中IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)較Con組無明顯變化,但I(xiàn)RS-2蛋白的絲氨酸磷酸化水平升高,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平減少,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照mimic-NC組相比,miR-802組IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)無顯著性改變,但I(xiàn)RS-2蛋白的磷酸化水平進(jìn)一步升高,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平均進(jìn)一步下降;下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照組 inhibitor-NC 組相比,miR-802-inhibitor 組 IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)仍無顯著性改變,但I(xiàn)RS-2蛋白的磷酸化水平降低,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平升高。4 MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對糖代謝的影響4.1 MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的影響與Con組相比,PA干預(yù)24小時后其培養(yǎng)基中葡萄糖濃度升高(P0.05);上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照mimic-NC組相比,miR-802組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度進(jìn)一步升高(P0.05);下調(diào)HepG2細(xì)胞 miR-802 的表達(dá)后,與對照 inhibitor-NC 組相比,miR-802-inhibitor組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低(PO.05)。4.2 MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對各組細(xì)胞葡萄糖代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的變化與Con組相比,PA組G6PCmRNA和蛋白表達(dá)均升高(P0.05);上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照mimic-NC組相比,G6PC的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P0.05);下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后,與對照inhibitor-NC組相比,G6PC無論mRNA還是蛋白表達(dá)均降低(P0.05)。第二部分MiR-802調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗及糖代謝的潛在機(jī)制和靶基因篩選目的:在明確miR-802對肝臟胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過基因表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)方法篩選miR-802影響肝臟胰島素敏感性的潛在靶點(diǎn),并通過Western-blot進(jìn)行體外驗(yàn)證。方法:HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染同第一部分工作,取其中的棕櫚酸干預(yù)組(PA),棕櫚酸 + miR-802 模擬物組(miR-802-mimic,miR-802),棕櫚酸+模擬物對照組(mimic negative control,NC)交由上海伯豪生物技術(shù)有限公司公司進(jìn)行Human Genome U133 Plus 2.0 Array型號的芯片檢測。通過對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析、功能富集分析篩選miR-802過表達(dá)所影響的信號通路,進(jìn)而推測miR-802調(diào)控肝臟糖代謝和胰島素敏感性的潛在機(jī)制。通過Targetscan對miR-802的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,同時結(jié)合芯片數(shù)據(jù)篩選出miR-802影響胰島素信號通路的靶基因,通過Westem-blot在HepG2細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后各組miR-802的mRNA的表達(dá)與PA干預(yù)組和對照NC組相比,過表達(dá)miR-802組,其miR-802的mRNA水平明顯升高(P0.05)。2芯片結(jié)果分析2.1主成份分析對PA組、miR-802組和NC三組樣本進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖3所示。在該圖中,NC組和PA組的表達(dá)譜相近,說明空載體轉(zhuǎn)染對整個體系無明顯影響;而這兩組與miR-802組在基因表達(dá)水平上有較大差異,說明miR-802的過表達(dá)從整體上影響了 HepG2細(xì)胞的基因表達(dá)。2.2差異基因篩選由于主成份分析結(jié)果顯示NC組和PA組表達(dá)譜相近,因此我們以NC組為對照,根據(jù)正文第二部分中2.3.2節(jié)的方法從miR-802組篩選差異基因,結(jié)果如圖3所示。與NC轉(zhuǎn)染組比較,miR-802轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株中有505個基因發(fā)生了顯著上調(diào)(倍數(shù)值2.0);有104個基因受到顯著下調(diào)(倍數(shù)值2.0)。2.3 MiR-802過表達(dá)體系的功能富集分析我們將差異基因分別映射到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行功能富集分析,結(jié)果如圖4所示。觀察圖4發(fā)現(xiàn),在排名前10位的信號通路中,miR-802的過表達(dá)顯著影響了磷酸肌醇信號通路和肌醇磷酸鹽代謝通路(TOP3)。芯片數(shù)據(jù)顯示,miR-802的過表達(dá)使磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞單位2(Phosphoinositide 3 kinase regulatory subunit,PIK3R2)的表達(dá)量減少約 2倍,人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)表達(dá)升高。PIK3R2 是 PI3K 的調(diào)節(jié)亞基 2,又被稱為PI3KP85調(diào)節(jié)亞基β。而我們Western blot所用的PI3K的抗體檢測的是P85亞基的水平,因此在蛋白水平上檢測PI3KP85的表達(dá)可以代表PIK3R2的蛋白表達(dá)。PIK3R2可以促進(jìn)磷酸肌醇三磷酸(Phosphoinositide 3 phosphoric acid,PIP3)的生成,而PTEN可以促進(jìn)PIP3去磷酸化從而生成PIP2。因此,下調(diào)的PIK3R2和上調(diào)的PTEN可能共同抑制PIP3的生成,進(jìn)而降低下游AKT的磷酸化水平,影響肝細(xì)胞的糖代謝和胰島素敏感性。此外,該通路的上游調(diào)控基因細(xì)胞因子信號抑制因子3(suppressors of cytokine signaling3,SOCS3)在 miR-802 過表達(dá)組上調(diào)了 1.9倍。SOCS3可以競爭性抑制IRS酪氨酸磷酸化,減少IRS與PI3K的調(diào)節(jié)亞單位P85的結(jié)合。因此,上調(diào)的SOCS3可能進(jìn)一步抑制PI3K-AKT信號通路。同時,該通路的下游基因葡萄糖6磷酸達(dá)組增加約1.7倍,提示miR-802可能通過PI3K-AKT通路促進(jìn)糖異酶催化亞基(Glucose 6 phosphatase catalytic subunit,G6PC)在 miR-802 過表生過程。該機(jī)制如圖5所示。綜上,miR-802的過表達(dá)可以使PI3K-AKT信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)量減少,SOCS3表達(dá)量增多,從而影響肝臟糖代謝過程,進(jìn)而影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性。3靶基因的預(yù)測及驗(yàn)證在確定了 miR-802影響糖代謝和胰島素敏感性等相關(guān)通路的基礎(chǔ)上,我們對其潛在的分子機(jī)制作了進(jìn)一步探索。通過Targetscan預(yù)測miR-802的靶基因,并結(jié)合表達(dá)譜芯片對預(yù)測到的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,取預(yù)測為陽性且在miR-802過表達(dá)組顯著下調(diào)的基因作為miR-802的靶點(diǎn),共篩選到17個候選靶基因,結(jié)果如圖7表所示。其中,肝細(xì)胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF1B)是青年人中的成年發(fā)病型糖尿病(maturity-onset diabetes mellitus of the young,MODY)的重要致病基因,大量研究表明其與疾病的關(guān)系。根據(jù)Targetscan的預(yù)測結(jié)果,miR-802與HNF1B的mRNA的3' UTR端有大于6個理論結(jié)合位點(diǎn)(Fig.8)。MiR-802可以通過這些位點(diǎn)與HNF1B的mRNA結(jié)合,以達(dá)到抑制HNF1B轉(zhuǎn)錄的作用,從而抑制HNF1B蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步通過WB檢測該蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-802的過表達(dá)使該基因下調(diào)約2倍(Fig9,Table3),提示HNF1B很可能是miR-802調(diào)控糖代謝的重要靶點(diǎn)。第三部分MiR-802通過HNF1B對高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟胰島素抵抗及糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制目的:在高脂誘導(dǎo)IR小鼠模型上,通過轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒(adeno-associated viral,AAV)調(diào)節(jié) miR-802 的表達(dá),體內(nèi)觀察 miR-802 的上/下調(diào)對其靶基因HNF1和PI3K-AKT信號通路的影響,同時檢測該通路上游基因和下游糖代謝通路上關(guān)鍵酶的表達(dá),揭示miR-802-HNFlB這一信號通路體內(nèi)調(diào)控胰島素抵抗和糖代謝的潛在機(jī)制。方法:5周齡C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為2組:對照組(Normal diet,ND)14 只,高脂組(high fat diet,HFD)60 只。對照組給予普通飼料D12450B喂養(yǎng),熱量組成:碳水化合物70%,蛋白質(zhì)20%,脂肪10%,總熱量為385 kal/100g。高脂組給予高脂飲食D12492喂養(yǎng),熱量組成:碳水化合物20%,蛋白質(zhì)20%,脂肪60%,總熱量為524 kal/100g。每日記錄攝食量,每周記錄兩次空腹體重,于高脂喂養(yǎng)12周后測空腹及進(jìn)食后血糖變化。每組隨機(jī)選6只小鼠行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT),并留尾靜脈血清測胰島素水平,計算QUICKI值和葡萄糖曲線下面積(AUCglu);隨后每組隨機(jī)選擇5只小鼠,處死后留取血及肝臟標(biāo)本。高脂誘導(dǎo)IR小鼠模型造模成功后,高脂模型組通過轉(zhuǎn)染miR-802的腺相關(guān)病毒來調(diào)節(jié)肝臟miR-802的表達(dá),分為五組:單純高脂飲食組(High-fat diet,HFD)、高脂飲食+miR-802 過表達(dá)組(miR-802)、高脂飲食+miR-802過表達(dá)對照組(GFP)、高脂飲食+miR-802敲低組(AAV-Sponge,miR-802-SP)、高脂飲食+miR-802敲低陰性對照組(AAV-Negative Control,NC))。注射腺相關(guān)病4 周后行 IPGTT 試驗(yàn),留取空腹尾靜脈血清測胰島素水平,并計算QUICKI值和AUCglu。隨后全部處死小鼠,留取血清及肝臟標(biāo)本,測定TC和TG,通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組小鼠肝臟miR-802的表達(dá),胰島素信號通路IRS-2、PI3K 和 AKT,及 G6PC、SOCS3 的 mRNA 水平。應(yīng)用 Western blot 技術(shù)檢測IRS-2和AKT總蛋白及磷酸化水平及PI3K和靶基因HNF1B蛋白表達(dá)的變化。應(yīng)用試劑盒測定各組小鼠肝臟糖原含量、GK活性和PEPCK活性。HE染色觀察小鼠肝臟形態(tài)變化。結(jié)果:1高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型的建立高脂飲食喂養(yǎng)12周后,HFD組小鼠體重高于ND組(P0.05);HFD組FBG水平較ND組略升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),進(jìn)食后血糖HFD組高于ND組,(P0.01);HFD組小鼠空腹血清INS、TC及TG水平高于ND組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。IPGTT結(jié)果示:HFD組15,、30'、60'血糖均較ND組升高(P0.05),HFD組AUCglu也顯著升高(P0.05)。與ND組相比,HFD組定量胰島素敏感性指數(shù)(Quantitative Insulin Sensitivity Check Index,QUICKI=1/[log(I0)+log(G0)])值明顯降低(P0.05)。2轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒后各組小鼠肝臟miR-802的mRNA水平比較與ND組相比,HFD組小鼠肝臟miR-802的mRNA水平明顯升高(P0.05),轉(zhuǎn)染AAV后4周后,miR-802組肝臟miR-802的mRNA水平較對照GFP組明顯升高(P0.05);miR-802-SP組肝臟miR-802的mRNA水平較對照NC組明顯降低(P0.05);且在熒光顯微鏡下可以看到肝臟切片綠色熒光的表達(dá),提示AAV轉(zhuǎn)染成功。3轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒后胰島素敏感性相關(guān)指標(biāo)的變化3.1各組小鼠一般指標(biāo)的變化注射AAV使miR-802的表達(dá)量升高或者降低后,各干預(yù)組小鼠的體重及攝食量與HFD組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。給予AAV轉(zhuǎn)染上調(diào)/下調(diào)miR-802的表達(dá)量后,miR-802組的INS和TG較對照GFP組升高;miR-802-SP組的INS和TG較對照NC組降低(P0.05);然而各干預(yù)組間血清TC水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.2各組小鼠胰島素敏感性比較IPGTT結(jié)果示:HFD組15'、30'、60'血糖均較ND組升高(P0.05),上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組30'血糖較對照GFP組升高(P0.05);15'、60'、120'血糖均較對照GFP組升高(P0.05)。下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組0'、30'血糖較對照NC組降低(P0.05)。HFD組AUCglu高于ND組,而QUICKI值較ND組明顯降低(P0.05);上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組AUCglu高于對照GFP組,而QUICKI值較對照GFP組降低(P0.05);下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組AUCglu較對照NC組降低,QUICKI值較對照NC組升高(P0.05)。提示高脂組小鼠發(fā)生胰島素抵抗,上調(diào)/下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后可影響胰島素敏感性。4 PI3K-AKT通路的變化4.1 PI3K-AKT通路上關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)比較與ND組相比,HFD組小鼠IRS-2、PI3K和AKT的mRNA表達(dá)下降(P0.05);上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,PI3K的mRNA表達(dá)較GFP組下降(P0.05),下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,PI3K的mRNA表達(dá)較NC組升高。無論上調(diào)或者下調(diào)miR-802的表達(dá),IRS-2和AKT的mRNA表達(dá)無明顯變化。4.2 PI3K-AKT信號通路的蛋白水平變化與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟的P-IRS-2/IRS-2的比值升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值降低;上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,p-IRS-2/IRS-2 的比值較對照GFP組升高,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 的比值降低,提示胰島素敏感性下降;下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,p-IRS-2/IRS-2的比值較對照NC組降低,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值升高(P0.05),提示下調(diào)肝臟miR-802的表達(dá)后改善了肝臟胰島素的敏感性。5 MiR-802靶基因HNF1B蛋白表達(dá)的變化與對照ND組相比,HFD組小鼠HNF1B蛋白水平降低;上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組HNF1B蛋白表達(dá)較GFP組明顯降低(P0.05);下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組HNF1B蛋白表達(dá)較NC組明顯升高;支持HNF1B是miR-802的靶基因。6肝臟糖代謝相關(guān)指標(biāo)的變化6.1肝臟糖原含量的變化與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟糖原含量降低;上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組小鼠肝臟糖原含量較對照GFP組降低(P0.05);下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組小鼠肝臟糖原含量較對照NC組升高(P0.05)。6.2肝臟GK和PEPCK活性與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟GK活性降低,PEPCK活性升高;上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組小鼠肝臟GK活性較對照GFP組降低(P0.05),PEPCK活性較對照GFP組明顯升高(P0.05);下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組小鼠肝臟GK活性較對照NC組升高(P0.05),PEPCK活性較對照NC組明顯降低(P0.05)。提示高脂飲食時肝臟糖異生增加,糖酵解減少,上調(diào)/下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后可影響肝臟糖代謝。6.3各組小鼠G6PC和SOCS3的mRNA水平比較與對照ND組相比,HFD組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平較對照GFP組升高(P0.05);下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平較對照NC組降低(P0.05)。7肝臟組織形態(tài)學(xué)比較ND組肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝小葉規(guī)則,肝細(xì)胞排列整齊,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,肝細(xì)胞中央有大而圓的核,細(xì)胞質(zhì)均勻,未見脂滴和炎癥細(xì)胞侵潤;HFD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞腫脹,肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見脂滴空泡,且可見小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞侵潤;上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802組可見肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂,肝細(xì)胞索消失,肝細(xì)胞變大,肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量圓形脂滴空泡,重者胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀改變,且小葉內(nèi)炎細(xì)胞侵潤程度較對照GFP組增加。上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后,miR-802-SP組小鼠肝臟可見肝細(xì)胞體積較對照NC組變小,胞漿內(nèi)脂滴減少,小葉內(nèi)炎細(xì)胞侵潤程度較對照組有所緩解。結(jié)論:1在細(xì)胞和動物水平驗(yàn)證了IR模型中miR-802的表達(dá)升高,并且與胰島素抵抗和糖代謝異常有關(guān)。。2在IR細(xì)胞模型上,通過表達(dá)譜芯片和靶基因預(yù)測軟件篩選出miR-802的潛在靶點(diǎn)HNF1B,進(jìn)一步的功能富集分析提示miR-802可能通過該靶點(diǎn)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路,進(jìn)而影響肝臟胰島素敏感性和糖代謝。3在高脂誘導(dǎo)IR的小鼠模型上進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-802-HNF1B這一通路對PI3K-AKT的調(diào)節(jié)作用,從動物水平說明了miR-802在調(diào)節(jié)肝臟胰島素敏感性和糖代謝方面的重要意義。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 Ke-Xin Gan;Chao Wang;Jin-Hu Chen;Chun-Jing Zhu;Guang-Yao Song;;Mitofusin-2 ameliorates high-fat diet-induced insulin resistance in liver of rats[J];World Journal of Gastroenterology;2013年10期

2 陳夢云;江國榮;;胰島素抵抗細(xì)胞模型研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)藥;2012年02期

3 Mustafa Abdo Saif Dehwah;;MicroRNAs and Type 2 Diabetes/Obesity[J];遺傳學(xué)報;2012年01期

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本文編號：1278449