本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分建立缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠心臟模型研究背景:糖尿病顯著增加心血管疾病的發(fā)生率和死亡率,循證醫(yī)學(xué)證明,約60%糖尿病患者死于心血管相關(guān)的并發(fā)癥。其中,冠心病是最主要死因,而缺血再灌注損傷在冠心病心肌損害過程中發(fā)揮重要作用。目前,糖尿病容易致冠心病的具體發(fā)病機(jī)制不完全清楚。對(duì)此,本實(shí)驗(yàn)擬通過糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的模型來探討相關(guān)的發(fā)病機(jī)制,探索最佳的治療方案。目的:建立缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠心臟模型。方法:(1)實(shí)驗(yàn)組小鼠高脂飼料喂養(yǎng)2周后,腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素110mg/kg建立糖尿病小鼠模型,對(duì)照組小鼠普通飼料喂養(yǎng)并腹腔內(nèi)注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。(2)分別于建模前及建模8周時(shí)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度,分析糖尿病小鼠神經(jīng)病變情況。(3)利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)評(píng)估缺血再灌注損傷對(duì)糖尿病小鼠心功能的影響,記錄心功能的參數(shù)。結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)組糖尿病小鼠的血糖水平明顯高于對(duì)照組(28.81±4.67 vs.8.56±1.64 mmol/L,P0.01),并維持高水平至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。(2)實(shí)驗(yàn)組糖尿病小鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯低于對(duì)照組(22.22±3.43 vs.31.29±2.48 m/s,P0.01),提示糖尿病小鼠出現(xiàn)神經(jīng)性病變。(3)經(jīng)歷缺血再灌注損傷后,糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、HR、CF均顯著下降,LVEDP升高,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:成功建立糖尿病小鼠模型,誘導(dǎo)出糖尿病神經(jīng)病變;建立糖尿病小鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注損傷模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)建立研究基礎(chǔ)。第二部分神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究背景:在糖尿病患者中,由于存在神經(jīng)病變,因此即使發(fā)生了嚴(yán)重的心肌缺血,疼痛癥狀往往較輕微或不典型,易被誤診或延誤病情。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是一種多肽物質(zhì),能夠維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的功能。已有研究證實(shí),神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以改善糖尿病大鼠心臟神經(jīng)功能,降低室性心律失常的發(fā)生率。然而,神經(jīng)生長(zhǎng)因子能否改善缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠的心臟功能尚無相關(guān)研究。目的:將NGF轉(zhuǎn)基因療法應(yīng)用于糖尿病合并心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?在其改善心臟神經(jīng)末梢功能的同時(shí),觀察缺血心臟的功能改善程度。方法:利用第一部分建立的糖尿病小鼠模型來探索神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的改善程度,具體包括:(1)制備表達(dá)小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組腺病毒(Ad-NGF)。(2)Western Blot實(shí)驗(yàn)研究糖尿病小鼠心臟NGF的表達(dá)水平。(3)將重組腺病毒(Ad-NGF)轉(zhuǎn)染至心肌組織。(4)建立離體心臟Langendorff灌流體系,觀察Ad-NGF對(duì)糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響,RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt 和 CF。(5)收集復(fù)灌期間的灌流液,測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。結(jié)果:(1)重組腺病毒感染293T細(xì)胞后,Western Blot檢測(cè)到目的基因融合蛋白的表達(dá),說明重組腺病毒構(gòu)建成功。(2)糖尿病小鼠心肌組織NGF表達(dá)顯著減少。轉(zhuǎn)染Ad-NGF后,NGF表達(dá)升高,說明目的基因成功轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞并且表達(dá)提高。(3)與對(duì)照小鼠心臟相比,糖尿病小鼠心臟在缺血再灌注后心功能明顯下降:LVSP、±dp/dt、CF 降低(P0.05),LVEDP、LDH 升高(P0.05)。(4)Ad-NGF轉(zhuǎn)染組心臟在缺血再灌注后心功能得到明顯改善,其LVSP、±dp/dt、CF 升高(P0.05),LVEDP、LDH 降低(P0.05)。結(jié)論:表達(dá)小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染至心肌組織,發(fā)揮改善糖尿病小鼠離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的作用。第三部分TRPV1途徑在神經(jīng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的糖尿病心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制中的作用研究背景:TRPV1受體是已知的位于感覺神經(jīng)末梢上的感受器,在心臟上有大量表達(dá)。已有研究證實(shí),激活TRPV1受體能改善小鼠心肌缺血再灌注損傷后的心功能。然而,NGF能否通過調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)TRPV1受體途徑改善糖尿病心臟缺血再灌注損傷后的心功能尚不清楚。目的:觀察Ad-NGF對(duì)糖尿病動(dòng)物模型心臟感覺神經(jīng)末梢TRPV1受體及其神經(jīng)遞質(zhì)CGRP、SP釋放的影響,并進(jìn)一步明確NGF能否通過調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)TRPV1受體途徑改善糖尿病缺血再灌注損傷后的心功能。方法:(1)Western Blot方法研究糖尿病小鼠心臟組織中TRPV1受體的表達(dá)情況,并用ELISA法測(cè)定心肌組織中CGRP和SP的含量。(2)將重組腺病毒(Ad-NGF)轉(zhuǎn)染至心肌組織。(3)建立離體心臟Langendorff灌流體系,缺血開始前5分鐘往灌流液中分別加入選擇性CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、選擇性SP受體拮抗劑RP67580或選擇性TRPV1受體激動(dòng)劑CAP,觀察上述物質(zhì)對(duì)糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響,以RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt 和 CF。(4)收集灌流液,ELISA法檢測(cè)灌流液中CGRP和SP的含量。結(jié)果:(1)與非糖尿病組比較,糖尿病組小鼠心肌組織中TRPV1受體表達(dá)減少(P0.05),下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP及SP的含量下降(P0.05)。(2)與未轉(zhuǎn)染組相比,Ad-NGF轉(zhuǎn)染組糖尿病小鼠心臟TRPV1受體表達(dá)增多(P0.05),下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP的合成和釋放增加(P0.05),SP的含量無顯著性變化(P0.05)。(3)離體心臟Langendorff灌流系統(tǒng)加入CGRP8-37處理后,糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、CF 下降,LVEDP 升高(P0.05);經(jīng) CAP 處理后,LVSP、±dp/dt、CF升高,LVEDP降低(P0.05);RP67580除降低CF外,對(duì)其他心功能指標(biāo)無明顯影響。結(jié)論:TRPV1途徑參與NGF介導(dǎo)的心臟保護(hù)過程,NGF通過上調(diào)TRPV1受體表達(dá)及下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP的釋放來改善糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后的心功能。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1278116