本文關(guān)鍵詞：黃芩苷通過(guò)microRNA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞通透性的保護(hù)機(jī)制

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【摘要】：背景和目的:代謝性炎癥是由攝入營(yíng)養(yǎng)物和代謝過(guò)剩觸發(fā)的一種低程度、慢性的系統(tǒng)性炎癥,可造成多種炎性分子如腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)表達(dá)和活性增強(qiáng)。代謝性炎癥的發(fā)生機(jī)制除了飽和脂肪酸等內(nèi)源性損傷以外,與外源性毒素也有關(guān)系,如革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的內(nèi)毒素(LPS)引起的一系列病理改變,通過(guò)腸道內(nèi)毒素激活TNF-α介導(dǎo)的腸道緊密連接蛋白表達(dá)改變,導(dǎo)致腸道屏障功能障礙,通透性升高,血液循環(huán)和腸道內(nèi)毒素水平升高,形成代謝性內(nèi)毒素血癥。最近的研究表明動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、肥胖這四種嚴(yán)重危害人類健康的疾病都存在代謝性炎癥這一共同特征。中藥黃芩苷已被證實(shí)具有明確的抗炎作用,中醫(yī)認(rèn)為它有清熱瀉火解毒的功效。本課題組前期研究顯示黃芩苷可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血清內(nèi)毒素(LPS)水平升高,并且可以抑制LPS導(dǎo)致的IEC-6腸上皮細(xì)胞TNF-α升高,對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白有保護(hù)作用,但黃芩苷是否直接通過(guò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷,對(duì)屏障功能產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。MicroRNA是一種調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等一系列進(jìn)程中發(fā)揮重要功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù),從microRNA角度探討黃芩苷對(duì)腸道通透性的影響機(jī)制,為中藥抗代謝性炎癥的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法:一、黃芩苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的保護(hù)作用研究IEC-6細(xì)胞設(shè)置正常對(duì)照組、TNF-α模型組、TNF-α+黃芩苷組,用CCK-8檢測(cè)IEC-6細(xì)胞活性;用細(xì)胞電阻儀檢測(cè)IEC-6細(xì)胞的通透性,用FITC Annexin V和PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。二、黃芩苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析將IEC-6細(xì)胞分為T(mén)NF-α組和TNF-α +黃芩苷組,TNF-α組給予50 ng/mL的TNF-α處理細(xì)胞24 h,TNF-α +黃芩苷組加入40 μg/mL黃芩苷預(yù)處理1 h后,再加入50 ng/mL TNF-α刺激24 h,提取細(xì)胞RNA,進(jìn)行microRNA測(cè)序。應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法,進(jìn)行miRNA表達(dá)差異和聚類分析,預(yù)測(cè)差異表達(dá)的miRNA靶基因,應(yīng)用DIANA TOOLS mirPath v.3.0軟件進(jìn)行差異表達(dá)miRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析。三、黃芩苷通過(guò)miR-191a對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制1.黃芩苷對(duì)TNF-α條件下IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響將IEC-6細(xì)胞分為正常組、TNF-α模型組、TNF-α +黃芩苷組,根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果對(duì)差異表達(dá)的miRNA預(yù)測(cè)的靶基因緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-8的表達(dá)進(jìn)行Western Blot檢測(cè),采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)ZO-1細(xì)胞間分布情況。2.黃芩苷通過(guò)miR-191a對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的1EC-6細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的影響首先用miR-191a模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞24 h,用熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)miR-191a和靶基因ZO-1的表達(dá)水平。再將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、黃芩苷組、TNF-α模型組、TNF-α+黃芩苷組、TNF-α+miR-191a抑制劑組、TNF-α +黃芩苷+miR-191a抑制劑組、TNF-α +黃芩苷+miRNA抑制劑陰性對(duì)照組、TNF-α +miR-191a模擬物組、TNF-α+黃芩苷+miR-191a模擬物組、TNF-α+黃芩苷+miRNA模擬物陰性對(duì)照組,檢測(cè)miR-191a和ZO-1的表達(dá)水平。3.黃芩苷通過(guò)miR-191a對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活性和遷移能力的影響設(shè)置正常對(duì)照組、黃芩苷組、TNF-α模型組、TNF-α +黃芩苷組、TNF-α +miR-191a抑制劑組、TNF-α +黃芩苷+miR-191a抑制劑組、TNF-p +黃芩苷+miRNA抑制劑陰性對(duì)照組。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生存率,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果:1.與正常對(duì)照組相比,不同濃度的黃芩苷(10,20,40 μg/mL)對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響,10,30,50 ng/mL TNF-p明顯降低IEC-6細(xì)胞生存率(P0.05),其中50 ng/mL TNF-p使細(xì)胞通透性升高,凋亡率增加。與TNF-p(50 ng/mL)模型組對(duì)比,不同濃度的黃芩苷(10,20,40 μg/mL)預(yù)處理使細(xì)胞生存率顯著升高(P0.01)。同時(shí)40 μg/mL黃芩苷預(yù)處理可以抑制TNF-α導(dǎo)致的細(xì)胞通透性升高,降低細(xì)胞凋亡率。2.經(jīng)過(guò)miRNA表達(dá)差異分析,黃芩苷預(yù)處理組和TNF-p組比較,表達(dá)差異的miRNA共40個(gè),其中上調(diào)7個(gè),下調(diào)33個(gè)miRNA表達(dá),KEGG通路分析顯示黃芩苷可能調(diào)控的靶基因與細(xì)胞緊密連接、細(xì)胞間隙連接、細(xì)胞粘附分子通路等密切相關(guān)。GO功能富集分析說(shuō)明黃芩苷可能影響細(xì)胞構(gòu)成、生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞核、蛋白連接相關(guān)細(xì)胞功能。miRNA靶基因預(yù)測(cè)提示黃芩背可能調(diào)控緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2 和 Claudin-8 的表達(dá)。3.和正常組比較,TNF-p處理24 h后,ZO-1表達(dá)顯著降低,Claudin-1、Claudin-8表達(dá)無(wú)明顯差異,Claudin-2的蛋白表達(dá)量明顯增加,和TNF-a組比較,黃芩苷預(yù)處理對(duì)Claudin-1、Claudin-8表達(dá)無(wú)明顯影響,但使ZO-1表達(dá)升高,并使Claudin-2的蛋白表達(dá)量降低。免疫熒光結(jié)果顯示,正常IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)連續(xù)、均勻,和正常組對(duì)比,TNF-α處理后細(xì)胞間ZO-1表達(dá)降低,且分布不均,和TNF-α組對(duì)比,黃芩苷+TNF-α組ZO-1表達(dá)增多且分布均勻連續(xù)。4.和對(duì)照組相比,miR-191a模擬物抑制Z0-1 mRNA和蛋白表達(dá),miR-191a抑制物增加ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)(P0.05)。黃芩苷單獨(dú)處理24 h對(duì)IEC-6細(xì)胞ZO-1的表達(dá)無(wú)明顯影響。和正常對(duì)照組比較,TNF-α處理24 h后,細(xì)胞miR-191a表達(dá)明顯升高,ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低(P0.05),黃芩苷預(yù)處理使miR-191a表達(dá)降低,ZO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05)。與TNF-α+黃芩苷組對(duì)比,TNF-α+黃芩苷+miR-191a抑制劑組中ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P0.05),與TNF-α+黃芩苷組對(duì)比,TNF-α+黃芩苷+miR-191a模擬物組中ZO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平下降(P0.05)。5.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,與正常對(duì)照組相比,單獨(dú)黃芩苷組(40 μg/mL)對(duì)IEC-6細(xì)胞的遷移率無(wú)明顯影響,TNF-α刺激后IEC-6細(xì)胞遷移率下降(P0.05),和TNF-α組相比,TNF-α+黃芩苷組細(xì)胞遷移加快(P0.05),此外和TNF-α+黃芩苷組比較,TNF-α+黃芩苷+miR-191a抑制劑組細(xì)胞遷移加快(P0.05)。結(jié)論:1.TNF-α能抑制IEC-6細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,通過(guò)升高miR-191a水平使靶基因緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)下降,并增加細(xì)胞孔隙構(gòu)成蛋白Claudin-2的表達(dá),使細(xì)胞遷移能力降低,破壞細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),使腸上皮細(xì)胞通透性升高,屏障功能受損。2.黃芩苷可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活性損傷,通過(guò)抑制miR-191a使靶基因ZO-1表達(dá)水平升高,維持細(xì)胞間正常緊密連接蛋白ZO-1分布,提高細(xì)胞的遷移能力,并降低Claudin-2的表達(dá),保護(hù)腸上皮細(xì)胞的正常通透性。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：1277658