本文關(guān)鍵詞：黃芩苷通過microRNA對TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細胞通透性的保護機制

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【摘要】：背景和目的:代謝性炎癥是由攝入營養(yǎng)物和代謝過剩觸發(fā)的一種低程度、慢性的系統(tǒng)性炎癥,可造成多種炎性分子如腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)表達和活性增強。代謝性炎癥的發(fā)生機制除了飽和脂肪酸等內(nèi)源性損傷以外,與外源性毒素也有關(guān)系,如革蘭氏陰性細菌細胞壁的內(nèi)毒素(LPS)引起的一系列病理改變,通過腸道內(nèi)毒素激活TNF-α介導(dǎo)的腸道緊密連接蛋白表達改變,導(dǎo)致腸道屏障功能障礙,通透性升高,血液循環(huán)和腸道內(nèi)毒素水平升高,形成代謝性內(nèi)毒素血癥。最近的研究表明動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、肥胖這四種嚴(yán)重危害人類健康的疾病都存在代謝性炎癥這一共同特征。中藥黃芩苷已被證實具有明確的抗炎作用,中醫(yī)認為它有清熱瀉火解毒的功效。本課題組前期研究顯示黃芩苷可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血清內(nèi)毒素(LPS)水平升高,并且可以抑制LPS導(dǎo)致的IEC-6腸上皮細胞TNF-α升高,對腸上皮細胞緊密連接蛋白有保護作用,但黃芩苷是否直接通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細胞損傷,對屏障功能產(chǎn)生影響有待進一步研究。MicroRNA是一種調(diào)控基因表達的非編碼RNA,在細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等一系列進程中發(fā)揮重要功能。本實驗結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù),從microRNA角度探討黃芩苷對腸道通透性的影響機制,為中藥抗代謝性炎癥的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法:一、黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細胞的保護作用研究IEC-6細胞設(shè)置正常對照組、TNF-α模型組、TNF-α+黃芩苷組,用CCK-8檢測IEC-6細胞活性;用細胞電阻儀檢測IEC-6細胞的通透性,用FITC Annexin V和PI染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。二、黃芩苷對TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細胞miRNA差異表達譜的生物信息學(xué)分析將IEC-6細胞分為TNF-α組和TNF-α +黃芩苷組,TNF-α組給予50 ng/mL的TNF-α處理細胞24 h,TNF-α +黃芩苷組加入40 μg/mL黃芩苷預(yù)處理1 h后,再加入50 ng/mL TNF-α刺激24 h,提取細胞RNA,進行microRNA測序。應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法,進行miRNA表達差異和聚類分析,預(yù)測差異表達的miRNA靶基因,應(yīng)用DIANA TOOLS mirPath v.3.0軟件進行差異表達miRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析。三、黃芩苷通過miR-191a對TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細胞的保護機制1.黃芩苷對TNF-α條件下IEC-6細胞緊密連接蛋白表達的影響將IEC-6細胞分為正常組、TNF-α模型組、TNF-α +黃芩苷組,根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果對差異表達的miRNA預(yù)測的靶基因緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-8的表達進行Western Blot檢測,采用細胞免疫熒光檢測ZO-1細胞間分布情況。2.黃芩苷通過miR-191a對TNF-α誘導(dǎo)的1EC-6細胞緊密連接蛋白ZO-1的影響首先用miR-191a模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染IEC-6細胞24 h,用熒光定量PCR和Western Blot檢測miR-191a和靶基因ZO-1的表達水平。再將細胞分為正常對照組、黃芩苷組、TNF-α模型組、TNF-α+黃芩苷組、TNF-α+miR-191a抑制劑組、TNF-α +黃芩苷+miR-191a抑制劑組、TNF-α +黃芩苷+miRNA抑制劑陰性對照組、TNF-α +miR-191a模擬物組、TNF-α+黃芩苷+miR-191a模擬物組、TNF-α+黃芩苷+miRNA模擬物陰性對照組,檢測miR-191a和ZO-1的表達水平。3.黃芩苷通過miR-191a對TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細胞活性和遷移能力的影響設(shè)置正常對照組、黃芩苷組、TNF-α模型組、TNF-α +黃芩苷組、TNF-α +miR-191a抑制劑組、TNF-α +黃芩苷+miR-191a抑制劑組、TNF-p +黃芩苷+miRNA抑制劑陰性對照組。用CCK-8法檢測細胞生存率,劃痕實驗檢測細胞遷移能力。結(jié)果:1.與正常對照組相比,不同濃度的黃芩苷(10,20,40 μg/mL)對IEC-6細胞增殖無明顯影響,10,30,50 ng/mL TNF-p明顯降低IEC-6細胞生存率(P0.05),其中50 ng/mL TNF-p使細胞通透性升高,凋亡率增加。與TNF-p(50 ng/mL)模型組對比,不同濃度的黃芩苷(10,20,40 μg/mL)預(yù)處理使細胞生存率顯著升高(P0.01)。同時40 μg/mL黃芩苷預(yù)處理可以抑制TNF-α導(dǎo)致的細胞通透性升高,降低細胞凋亡率。2.經(jīng)過miRNA表達差異分析,黃芩苷預(yù)處理組和TNF-p組比較,表達差異的miRNA共40個,其中上調(diào)7個,下調(diào)33個miRNA表達,KEGG通路分析顯示黃芩苷可能調(diào)控的靶基因與細胞緊密連接、細胞間隙連接、細胞粘附分子通路等密切相關(guān)。GO功能富集分析說明黃芩苷可能影響細胞構(gòu)成、生物進程、分子功能、細胞核、蛋白連接相關(guān)細胞功能。miRNA靶基因預(yù)測提示黃芩背可能調(diào)控緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Claudin-2 和 Claudin-8 的表達。3.和正常組比較,TNF-p處理24 h后,ZO-1表達顯著降低,Claudin-1、Claudin-8表達無明顯差異,Claudin-2的蛋白表達量明顯增加,和TNF-a組比較,黃芩苷預(yù)處理對Claudin-1、Claudin-8表達無明顯影響,但使ZO-1表達升高,并使Claudin-2的蛋白表達量降低。免疫熒光結(jié)果顯示,正常IEC-6細胞緊密連接蛋白ZO-1表達連續(xù)、均勻,和正常組對比,TNF-α處理后細胞間ZO-1表達降低,且分布不均,和TNF-α組對比,黃芩苷+TNF-α組ZO-1表達增多且分布均勻連續(xù)。4.和對照組相比,miR-191a模擬物抑制Z0-1 mRNA和蛋白表達,miR-191a抑制物增加ZO-1 mRNA和蛋白表達(P0.05)。黃芩苷單獨處理24 h對IEC-6細胞ZO-1的表達無明顯影響。和正常對照組比較,TNF-α處理24 h后,細胞miR-191a表達明顯升高,ZO-1 mRNA和蛋白表達降低(P0.05),黃芩苷預(yù)處理使miR-191a表達降低,ZO-1mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P0.05)。與TNF-α+黃芩苷組對比,TNF-α+黃芩苷+miR-191a抑制劑組中ZO-1 mRNA和蛋白表達水平升高(P0.05),與TNF-α+黃芩苷組對比,TNF-α+黃芩苷+miR-191a模擬物組中ZO-1mRNA和蛋白表達水平下降(P0.05)。5.劃痕實驗顯示,與正常對照組相比,單獨黃芩苷組(40 μg/mL)對IEC-6細胞的遷移率無明顯影響,TNF-α刺激后IEC-6細胞遷移率下降(P0.05),和TNF-α組相比,TNF-α+黃芩苷組細胞遷移加快(P0.05),此外和TNF-α+黃芩苷組比較,TNF-α+黃芩苷+miR-191a抑制劑組細胞遷移加快(P0.05)。結(jié)論:1.TNF-α能抑制IEC-6細胞的增殖,促進細胞凋亡,通過升高miR-191a水平使靶基因緊密連接蛋白ZO-1的表達下降,并增加細胞孔隙構(gòu)成蛋白Claudin-2的表達,使細胞遷移能力降低,破壞細胞間緊密連接結(jié)構(gòu),使腸上皮細胞通透性升高,屏障功能受損。2.黃芩苷可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細胞凋亡和細胞活性損傷,通過抑制miR-191a使靶基因ZO-1表達水平升高,維持細胞間正常緊密連接蛋白ZO-1分布,提高細胞的遷移能力,并降低Claudin-2的表達,保護腸上皮細胞的正常通透性。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：1277658