本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞β-arrestin-1及CB2受體在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：在全世界范圍內(nèi),潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病呈現(xiàn)越來越高的趨勢,在美國,每年用在治療潰瘍性結(jié)腸炎上的花費大概為81-149億美元,而在歐洲,這個費用高達(dá)291億歐元。在我國,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高,潰瘍性結(jié)腸炎患者的人數(shù)也逐年增多,另外由于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制并不確切,目前所有的藥物只能控制癥狀而不能徹底治愈,給全社會和患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。更值得關(guān)注的是,遷延不愈的結(jié)腸炎到最后很有可能發(fā)展為結(jié)腸癌,所以深入挖掘潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制,以及尋找新的藥物治療靶點對于潰瘍性結(jié)腸炎的防治具有至關(guān)重要的意義。為了解決這一問題,本課題分為以下兩個部分進(jìn)行。第一部分為巨噬細(xì)胞β-arrestin-1在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)調(diào)控及作用研究。文獻(xiàn)報道,全身敲除β-arrestin-1可以保護(hù)DSS和TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,而非造血細(xì)胞系β-arrestin-1敲除則加重DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,說明不同細(xì)胞來源的β-arrestin-1對結(jié)腸炎的作用是不同的。為了明確造血細(xì)胞系的β-arrestin-1對腸炎的作用,本課題組利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)培育了髓系(巨噬細(xì)胞)β-arrestin-1特異性敲除小鼠(β-arrestin-1floxp/floxpLysM-Cre),通過與野生型小鼠比較,發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1floxp/floxp LysM-Cre小鼠對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎耐受性增加,表現(xiàn)為體重下降程度減輕,血便和結(jié)腸組織HE評分降低,說明髓系β-arrestin-1可以促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)病。接著我們提取了野生型和β-arrestin-1floxp/floxpLysM-Cre小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,給予TNF-α刺激,發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1敲除后,TNF-α誘導(dǎo)的炎癥因子水平降低。進(jìn)一步我們通過Western blot,免疫熒光和EMSA對β-arrestin-1促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了探索,結(jié)果發(fā)現(xiàn),β-arrestin-1可以促進(jìn)TNF-α引起的巨噬細(xì)胞NF-κB和MAPK通路的活化,此外,免疫共沉淀表明,β-arrestin-1可以直接與NF-κB通路上的IKK和IκBα結(jié)合。另外,在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中,我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1的水平增加,同時在RAW264.7和體外培養(yǎng)的腹腔巨噬細(xì)胞中,TNF-α刺激也可以導(dǎo)致β-arrestin-1表達(dá)增加。為了明確β-arrestin-1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,我們利用雙熒光素酶報告基因技術(shù),發(fā)現(xiàn)NF-κB可能介導(dǎo)了β-arrestin-1的基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步利用NF-κB活化抑制劑BAY11-7082證實了NF-κB確實能夠調(diào)控β-arrestin-1的表達(dá)。通過這一部分實驗,我們發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞β-arrestin-1可以通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NF-κB和MAPK通路的活化來增加炎癥因子的表達(dá),從而使結(jié)腸炎加重,同時在結(jié)腸炎發(fā)生時,巨噬細(xì)胞又可以通過NF-κB調(diào)控β-arrestin-1的表達(dá),本項實驗從細(xì)胞特異性角度出發(fā)的思路可能會為潰瘍性結(jié)腸炎的治療策略提供新的研究方向。第二部分為激活I(lǐng)I型大麻素(Cannabinoid receptor 2,CB2)受體保護(hù)潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究。激活CB2受體可以產(chǎn)生抗炎作用,例如我們實驗室已經(jīng)發(fā)表的一篇文章揭示在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中,激動CB2受體可以減少滑膜細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生,并且抑制滑膜細(xì)胞的增生,降低關(guān)節(jié)中骨的破壞和白細(xì)胞的浸潤,從而減輕關(guān)節(jié)炎的癥狀。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的保護(hù)機(jī)制,通過降解物質(zhì)可以為細(xì)胞提供能量,殺滅病原體可以使細(xì)胞免受侵害,其在細(xì)胞增殖,分化和死亡過程中發(fā)揮著重要作用;自噬能夠降低過度激活的炎癥免疫反應(yīng),因此參與多種疾病如腫瘤、感染、神經(jīng)退行性病變和炎癥的調(diào)控。在前期的工作中,本課題組發(fā)現(xiàn)激活CB2受體可以增加小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2細(xì)胞)的自噬,抑制NLRP3炎性小體的活性從而減輕小鼠自身免疫性腦脊髓炎。在這部分實驗中,我們發(fā)現(xiàn)給小鼠腹腔注射CB2受體激動劑HU 308可以明顯改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀,而CB2受體敲除小鼠對DSS的敏感性增加,結(jié)腸炎癥狀更嚴(yán)重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),激活CB2受體,小鼠結(jié)腸組織和巨噬細(xì)胞內(nèi)的NLRP3生成減少,前體Caspase-1轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1的水平也降低,同時前體IL-1β生成減少,而自噬相關(guān)蛋白Beclin-1,LC3-II/LC3-I水平增加,SQSTM1減少;與野生型相比,CB2受體敲除導(dǎo)致小鼠結(jié)腸和巨噬細(xì)胞表達(dá)更多的NLRP3和前體IL-1β,且前體Caspase-1轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1增多,而自噬水平降低。為了明確自噬在CB2受體抑制NLRP3炎性小體中發(fā)揮的作用,我們用自噬相關(guān)基因5(autophagy targeted gene,Atg5)的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾掉RAW264.7的自噬過程,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atg5 siRNA部分取消了CB2受體激動劑HU 308對NLRP3炎性小體的抑制作用,同時小鼠體內(nèi)給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)也削弱了HU 308對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的保護(hù)作用和對NLRP3炎性小體的抑制效果。最后,我們檢測了自噬相關(guān)的信號通路,發(fā)現(xiàn)AMPK-mTOR-P70S6K介導(dǎo)了CB2受體對NLRP3炎性小體的抑制作用。由此,本項實驗得出激活CB2受體可以通過增加自噬來抑制NLRP3炎性小體的活性,從而發(fā)揮保護(hù)結(jié)腸炎作用的結(jié)論,有望成為潰瘍性結(jié)腸炎治療的新策略和新靶點。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R574.62

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本文編號：1277647