本文關(guān)鍵詞：喉癌患者中醫(yī)體質(zhì)類型分析及痰瘀對喉癌裸鼠miRNA表達影響的研究

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【摘要】：目的:喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率、死亡率較高,嚴重威脅著人民的生命健康。中醫(yī)體質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性,目前關(guān)于體質(zhì)與喉癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究并不多見,探究與喉癌發(fā)生相關(guān)的中醫(yī)體質(zhì)類型,對于臨床中調(diào)整患者體質(zhì)偏頗,預(yù)防喉癌有著重要的意義。導師團隊經(jīng)過20多年的研究,逐步發(fā)現(xiàn)并證實了痰瘀相關(guān)證候(血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證)是喉癌形成的基本證型,揭示痰瘀相關(guān)證候與喉癌形成之間的基因?qū)W機制,有望為喉癌的藥物治療提供準確靶點。本課題將通過臨床調(diào)查研究,探究喉癌患者的中醫(yī)體質(zhì)類型特點,為喉癌的早期預(yù)防提供依據(jù);其次,將通過實驗研究,觀察痰瘀相關(guān)證候?qū)戆┞闶竽[瘤生長的影響,并檢測miRNA在痰瘀相關(guān)證候裸鼠腫瘤模型上的差異表達情況,分析痰瘀相關(guān)證候影響喉鱗癌細胞增殖的基因?qū)W機制。方法:1.文獻研究通過文獻回顧,總結(jié)中醫(yī)體質(zhì)的概念、分型、影響因素等,分析中醫(yī)體質(zhì)與發(fā)病的關(guān)系,回顧中醫(yī)體質(zhì)與惡性腫瘤關(guān)系的研究進展。2.臨床研究根據(jù)國醫(yī)大師王琦教授的"體質(zhì)九分法"建立臨床病例觀察表,采用問卷調(diào)查法,根據(jù)嚴格的納排標準,納入喉癌組患者67例,來源于2014年1月-2017年2月期間在廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院就診并確診為喉癌的患者;對照組53例,來源于同期收集的廣州市白云區(qū)三元里社區(qū)健康居民。對兩組人群進行中醫(yī)體質(zhì)評分,建立數(shù)據(jù)庫,判斷兩組人群的中醫(yī)體質(zhì)類型,分析喉癌患者的中醫(yī)體質(zhì)特點。3.實驗研究將Hep-2喉鱗癌細胞進行培養(yǎng)、傳代;制作痰瘀相關(guān)證候(血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證)裸鼠模型,并對模型進行評價;將生長狀態(tài)良好的Hep-2喉癌細胞接種到已造模成功的裸鼠右側(cè)腋窩部皮下,觀察各組裸鼠在體瘤生長情況;腫瘤取材后以MTT法檢測細胞活性,以高通量法檢測瘤體細胞中的miRNA表達情況,并通過實時定量PCR檢測目的基因表達情況。成果:1.臨床研究對67例喉癌患者及53例健康對照組人群進行中醫(yī)體質(zhì)分析,兩組人群的體質(zhì)類型總體比較有統(tǒng)計學差異(P0.05),說明兩組人群體質(zhì)類型存在差異。同時,對每一體質(zhì)類型分別進行比較,發(fā)現(xiàn)喉癌組瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)人數(shù)明顯多于對照組(P0.05),喉癌組平和質(zhì)人數(shù)明顯少于對照組(P0.05)。九種體質(zhì)類型中除平和質(zhì)外,其余八種皆為偏頗體質(zhì)。喉癌組中平和質(zhì)7例,占本組總?cè)藬?shù)的10.4%,偏頗體質(zhì)60例,占89.6%;對照組中平和質(zhì)27例,占本組總?cè)藬?shù)的50.9%,偏頗體質(zhì)26例,占49.1%。調(diào)查還發(fā)現(xiàn),八種偏頗體質(zhì)既可單獨出現(xiàn),也可與其他偏頗體質(zhì)兼見,同時具有兩種及以上偏頗體質(zhì)者稱為兼夾體質(zhì)。喉癌組的60例偏頗體質(zhì)中,屬單一偏頗體質(zhì)者27例,占40.3%,屬兼夾體質(zhì)者33例,占49.3%;對照組的26例偏頗體質(zhì)中,屬單一偏頗體質(zhì)者11例,占20.80%,屬兼夾體質(zhì)者15例,占28.3%。喉癌組中瘀血質(zhì)24例(包括單一瘀血質(zhì)6例,瘀血質(zhì)兼其他偏頗體質(zhì)18例),對照組中瘀血質(zhì)3例(包括單一瘀血質(zhì)0,瘀血質(zhì)兼其他3例),兩者比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。喉癌組中痰濕質(zhì)25例(包括單一痰濕質(zhì)3例,痰濕質(zhì)兼其他22例),對照組中痰濕質(zhì)6例(包括單一痰濕質(zhì)0,痰濕質(zhì)兼其他6例),兩者比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。其余六種體質(zhì)類型(氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、濕熱質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì))分別比較,無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)為虛性體質(zhì)類型,將兩組虛性體質(zhì)者分別合并后,各體質(zhì)類型人數(shù)由多到少排序為:喉癌組,虛性體質(zhì)痰濕質(zhì)瘀血質(zhì)濕熱質(zhì)氣郁質(zhì)平和質(zhì)特稟質(zhì);對照組,平和質(zhì)虛性體質(zhì)濕熱質(zhì)氣郁質(zhì)痰濕質(zhì)瘀血質(zhì)特稟質(zhì)。虛性體質(zhì)者在兩組人群中均占有較大比例,喉癌組46.3%,對照組32.1%。2.實驗研究(1)完成了痰瘀相關(guān)證候(血瘀證、痰證、痰�；ソY(jié)證)裸小鼠模型的制作和評價:與對照組比較,血瘀證組裸小鼠出現(xiàn)了形體消瘦,時有寒戰(zhàn),反應(yīng)減弱,皮膚暗紅無光澤,耳、爪、尾部等出現(xiàn)瘀點瘀斑,背部青筋顯露,唇周暗紅,舌色紫黯等表現(xiàn),以及體重增長緩慢,攝食量、飲水量減少,尾出血時間和凝血時間(玻管法)顯著縮短等癥狀體征和實驗室指標的變化,符合血瘀證動物模型的特征性表現(xiàn);痰證組裸小鼠出現(xiàn)了肥胖、行動遲緩、嗜臥少動、喜扎堆、大便黏膩不成形等表現(xiàn),以及體重增長加快,攝食量、飲水量減少,血脂顯著升高等癥狀體征和實驗室指標的變化,符合痰證動物模型的特征性表現(xiàn);痰瘀互結(jié)證組裸小鼠出現(xiàn)了形體稍胖,嗜臥少動,行動遲緩,蜷臥喜扎堆,皮膚暗紅色,耳、爪、尾部出現(xiàn)瘀點瘀斑,背部青筋顯露,唇周暗紅,舌色紫黯,大便黏膩不成形等表現(xiàn),以及體重增長緩慢,攝食量、飲水量顯著減少,尾出血時間和凝血時間(玻管法)顯著縮短,血脂顯著升高等癥狀體征和實驗室指標的變化,符合痰瘀互結(jié)證動物模型的特征性表現(xiàn)。(2)將喉鱗癌細胞接種到四組裸鼠腋窩部皮下后成功成瘤。觀察各組裸鼠的在體瘤生長情況,血瘀證組裸鼠腫瘤生長速度較對照組加快,時間點出現(xiàn)在腫瘤接種后第20天(約第3周),痰證組、痰瘀互結(jié)證組裸鼠腫瘤生長速度與對照組比較無顯著差異。腫瘤接種后第28天,三個模型組裸鼠的喉癌體積、喉癌重量與對照組比較,無顯著差異(P0.05)。(3)通過MTT實驗檢測不同模型組裸鼠在體喉癌細胞的活性,血瘀證組、痰證組、痰瘀互結(jié)證組裸鼠在體喉癌細胞活性均高于對照組(P0.05)。(4)高通量法測序結(jié)果:血瘀證組、痰證組、痰瘀互結(jié)證組喉癌裸鼠的喉癌細胞中均出現(xiàn)mmiRNA異常表達。血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與對照組比較,血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與痰證組比較,均有大量miRNA表達上調(diào)或下調(diào);而痰證組與對照組比較、血瘀證組與痰瘀互結(jié)證組比較,miRNA表達上調(diào)或下調(diào)數(shù)量相對較少。經(jīng)去重復(fù)、文獻回顧篩選后初步確定10個miRNA為血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證影響喉癌裸鼠喉癌細胞miRNA異常表達的目的基因,經(jīng)PCR檢測證實有5個miRNA在模型組裸鼠喉癌細胞中出現(xiàn)顯著異常表達,分別為 miR-27a-5p、miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p。血瘀證組、痰瘀互結(jié)證組與對照組比較異常表達的miRNA相同:miR-27a-5p 呈高表達;miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p 呈低表達。痰證組與對照組比較:miR-27a-5p呈高表達,miR-708-5p呈低表達。結(jié)論:1.臨床研究喉癌患者中醫(yī)體質(zhì)類型以瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)為主,兼有較多虛性體質(zhì),據(jù)此推測喉癌的發(fā)生可能與瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)、虛性體質(zhì)有關(guān)。2.實驗研究血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使喉癌細胞活性增強、促進喉癌細胞增殖;在體外成瘤實驗中,血瘀證對喉癌細胞增殖促進作用更為顯著;血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證促進喉癌細胞增殖的基因?qū)W機制可能是通過使喉癌細胞中的miRNA發(fā)生異常表達實現(xiàn)的:血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使miR-27a-5p表達上調(diào),從而促進喉癌細胞增殖,推測mmiR-27a-5p可能為促進喉癌細胞增殖的基因;血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證可使mmiR-708-5p 表達下調(diào),血瘀證、痰�；ソY(jié)證可使 miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p表達下調(diào),從而使喉癌細胞的增殖失去抑制作用,促進喉癌的發(fā)展,推測miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p可能為抑制喉癌細胞增殖的基因。3.展望調(diào)整體質(zhì)偏頗,改善瘀血質(zhì)、痰濕質(zhì)、虛性體質(zhì)對預(yù)防喉癌有著重要的意義。在喉癌的治療中,對血瘀證、痰證、痰瘀互結(jié)證的喉癌可有望通過"化痰祛瘀"法治療,以抑制喉癌細胞的增殖,這對喉癌的臨床治療有重要的意義。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R273

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