本文關(guān)鍵詞：新型場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器用于心衰相關(guān)標(biāo)志物和中藥調(diào)控心肌細(xì)胞鈣離子釋放的監(jiān)測(cè)

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【摘要】：隨著我國(guó)人口老齡化的發(fā)展,心腦血管疾病發(fā)病率逐年遞增,而大多數(shù)心腦血管疾病最終都會(huì)導(dǎo)致患者心衰,心衰疾病死亡率近年來(lái)大幅度遞增。心衰,是很多復(fù)雜病因?qū)е滦募∈湛s-舒張能力變低,引起心輸出量相對(duì)減少的病理過(guò)程。在這一過(guò)程中,心衰患者心室內(nèi)壓和室壁張力增大即會(huì)導(dǎo)致心衰疾病標(biāo)志物B型腦鈉肽(Brain Natriuretic Peptide,BNP)的釋放,血液中BNP含量會(huì)隨著心衰的嚴(yán)重程度從正常的~6 pM水平增加到~600 pM;還有心肌細(xì)胞中最重要的第二信使鈣離子(Ca2+),隨著心動(dòng)周期變化,通過(guò)肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+吸收、儲(chǔ)存、釋放調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,從而調(diào)節(jié)心肌的興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程,三個(gè)環(huán)節(jié)中任意一個(gè)出現(xiàn)障礙,都將影響該過(guò)程,致使心肌收縮力下降,引起心衰。因此,我們選擇這兩種具有代表性的與心衰相關(guān)的標(biāo)志物,希望分別在血漿中和細(xì)胞水平上進(jìn)行研究,實(shí)現(xiàn)心衰疾病的高靈敏度、快速檢測(cè),有利于心衰疾病的早期診斷和預(yù)防。有研究表明,人參的活性成分人參總皂苷(Ginseng Total Saponins,GS)能有效地改善血流動(dòng)力學(xué),抑制心室重構(gòu)的進(jìn)行,從而保護(hù)心功能。黃連的活性成分黃連小檗堿(Berberine,Ber)既可抗心律失常,又對(duì)心衰的發(fā)生和心肌的能量代謝有良好的保護(hù)作用。兩種中藥的有效成分對(duì)血漿BNP水平和心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度都有影響,而“人參、黃連”又為中醫(yī)里面比較經(jīng)典的藥對(duì)之一,很多研究都致力于此積極探討這兩種中藥活性成分防治心衰的機(jī)理。但大多數(shù)結(jié)合中藥調(diào)控Ca2+研究心衰疾病都是基于細(xì)胞釋放Ca2+到血漿后,研究血漿中Ca2+濃度反應(yīng)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與心衰相關(guān)性。因而,在細(xì)胞層面原位監(jiān)測(cè)研究中藥調(diào)控心肌細(xì)胞Ca2+的釋放,有助于現(xiàn)代中藥防治心衰機(jī)制的研究。近年來(lái)隨著納米科學(xué)與界面科學(xué)的蓬勃發(fā)展,基于納米材料的第三代場(chǎng)效應(yīng)晶體管(Field Effect Transistor,FET)生物傳感器引起了世人極大關(guān)注,其研究涉及到生物、信息、物理、化學(xué)等多個(gè)重要領(lǐng)域,對(duì)臨床檢測(cè)、遺傳分析、環(huán)境檢測(cè)、生物反恐和國(guó)家安防等多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生了革命性的影響,因而成為國(guó)際上的研究前沿和熱點(diǎn)。利用fet靈敏度高、分析速度快、試劑消耗少、操作簡(jiǎn)單、免標(biāo)記、本身就具有信號(hào)放大功能的特點(diǎn)與納米材料比表面積大、吸附能力強(qiáng)、催化效率高、表面活性位點(diǎn)多等優(yōu)勢(shì)結(jié)合,在實(shí)際應(yīng)用方面空間廣闊。特別是石墨烯在眾多納米材料中表現(xiàn)出了更為優(yōu)異的理化性質(zhì),有極好的熱電傳導(dǎo)性、高機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性,在構(gòu)建生物傳感器,檢測(cè)生物分子方面具有得天獨(dú)厚的電學(xué)優(yōu)勢(shì)。因而基于石墨烯的fet生物傳感新方法可以為心衰疾病的檢測(cè)提供新方法。本論文擬構(gòu)建一種新型場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器——鉑納米顆粒(platinumnanoparticles,ptnps)修飾的還原氧化石墨烯(rgo)fet生物傳感器,集成微過(guò)濾系統(tǒng),用于全血中心衰標(biāo)志物bnp的高靈敏、高特異性快速檢測(cè);另外,構(gòu)建了基于還原氧化石墨烯/二氧化鈦(rgo/tio2)功能化的場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器在細(xì)胞水平原位監(jiān)測(cè)細(xì)胞ca2+的釋放,從而了解細(xì)胞內(nèi)外ca2+濃度的變化,并探索有效的方法實(shí)現(xiàn)傳感器的再生;最后,將該傳感器用于研究中藥活性成分人參總皂苷合黃連小檗堿對(duì)心肌細(xì)胞ca2+釋放的影響,為探討中藥配伍對(duì)心衰疾病的治療機(jī)理提供理論和技術(shù)支持。第一部分:鉑納米顆粒/石墨烯功能化場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器全血中檢測(cè)bnp。首先利用光刻技術(shù)和電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在硅片上用圖案掩膜法沉積50nm厚度的金電極,制備成晶體管芯片。在傳統(tǒng)的hummer制備方法上改進(jìn)合成了氧化石墨烯(go),合成的go在水合肼的作用下還原生成還原氧化石墨烯(rgo)。在傳感溝道中利用滴涂法沉積rgo作為導(dǎo)電溝道,然后在rgo界面用紫外光照還原na2ptcl4的方法沉積ptnps,制備成ptnps/rgofet生物傳感器。將bnp抗體蛋白分子通過(guò)pt-s鍵固定在鉑納米顆粒表面,當(dāng)全血樣本中有bnp存在時(shí),通過(guò)抗原-抗體結(jié)合,bnp就可以結(jié)合到傳感表面。由于bnp帶電荷,bnp結(jié)合前后會(huì)導(dǎo)致石墨烯表面載流子濃度的變化和電荷的結(jié)構(gòu)重排,從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移特性曲線中狄拉克點(diǎn)的變化。通過(guò)檢測(cè)傳感器電流變化就可以監(jiān)測(cè)全血中bnp量的變化。然后與傳統(tǒng)的過(guò)濾系統(tǒng)集成一體,可以快速檢測(cè)人血實(shí)際樣本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法檢測(cè)范圍為:100fm~1nm,線性方程為:?i(na)=-10.43lgcbnp(m)-140.40,檢出限為100fm。為了實(shí)現(xiàn)全血中bnp的直接檢測(cè),用微過(guò)濾器處理全血樣本得到血清樣本,將該生物傳感器實(shí)施血清中bnp的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)隨著血液中bnp濃度增加,信號(hào)響應(yīng)增大,表明該ptnps/rgofet生物傳感器集成微過(guò)濾系統(tǒng)裝置可實(shí)現(xiàn)血液樣本中心衰標(biāo)志物的檢測(cè)。第二部分:基于二氧化鈦/石墨烯功能化場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器原位監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放ca2+。根據(jù)文獻(xiàn)制備石墨烯與二氧化鈦(tio2)的復(fù)合物rgo/tio2納米材料,在已構(gòu)建的rgofet傳感界面將rgo/tio2復(fù)合物滴涂在芯片的傳感區(qū)域,構(gòu)建三明治夾心結(jié)構(gòu)的rgo/tio2/rgofet傳感器。然后將ca2+探針?lè)肿觙luo4-am通過(guò)π-π堆積的方式固定在石墨烯傳感界面上,由于ca2+帶正電荷,利用探針?lè)肿优c靶標(biāo)分析物結(jié)合時(shí)電荷由4e變化為2e的電學(xué)特性,促進(jìn)導(dǎo)電溝道表面?zhèn)鲗?dǎo)電荷分布的變化,從而引起rgo/tio2/rgofet生物傳感器電學(xué)性能變化,實(shí)現(xiàn)溶液中ca2+濃度的監(jiān)測(cè)。用該傳感器分別在pbs和fbs體系中實(shí)施了ca2+的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。研究結(jié)果表明,隨著ca2+濃度的增加,電流信號(hào)變小。在pbs溶液中,在100pm~1mm濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)性,線性方程為:?i(na)=36.97lgc(m)+363.08,檢出限為100pm。在fbs溶液中,在1nm~1mm濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)性,線性方程為:?i(na)=32.49lgc(m)+332.43,檢出限為1nm。將該fluo4-am功能化的rgo/tio2/rgofet生物傳感器用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)的ca2+釋放監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞培養(yǎng)在傳感芯片表面,在高鉀刺激劑刺激細(xì)胞后,細(xì)胞會(huì)釋放出ca2+,從而引起傳感器電流信號(hào)的下降,說(shuō)明該傳感器能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞Ca2+釋放的原位監(jiān)測(cè)。由于TiO2納米顆粒是一種光敏材料,具有光催化自清潔作用,該傳感器在強(qiáng)紫外光照射下,產(chǎn)生活性氧自由基降解有機(jī)生物分子,使傳感界面的細(xì)胞和探針?lè)肿咏到?實(shí)現(xiàn)傳感器的再生功能。第三部分:人參總皂苷合黃連小檗堿調(diào)控心肌細(xì)胞鈣離子釋放的監(jiān)測(cè)利用Fluo 4-AM功能化的RGO FET生物傳感器監(jiān)測(cè)兩種中藥人參和黃連的活性成分GS和Ber調(diào)控心肌細(xì)胞Ca2+釋放。實(shí)驗(yàn)選擇了Ber、GS、GS+Ber三組藥物與無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)心肌細(xì)胞孵育,利用構(gòu)建的Fluo 4-AM功能化的RGO FET生物傳感器分別監(jiān)測(cè)三組中藥孵育后心肌細(xì)胞Ca2+釋放,以電學(xué)信號(hào)下降百分比衡量Ca2+濃度的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ber、GS和GS+Ber分別致使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度下降22.4%、27.1%和41.5%。說(shuō)明Ber、GS和GS+Ber三組藥物孵育的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均有減小。因?yàn)檫@三組藥物對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度都有抑制作用,促使胞內(nèi)Ca2+濃度減小,在高鉀刺激劑刺激細(xì)胞時(shí)Ca2+釋放量也相應(yīng)減小。由于Ber可以通過(guò)降低心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度而起到改善心臟舒張功能的作用,而GS可以保護(hù)心肌細(xì)胞中線粒體鈣泵活性,保護(hù)膜系統(tǒng)完整,降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度,防止心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷。兩者共同作用時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載有更好的改善作用。該結(jié)果說(shuō)明Fluo 4-AM功能化的RGO FET生物傳感器能有效的應(yīng)用于中藥調(diào)控心肌細(xì)胞Ca2+釋放原位監(jiān)測(cè),為心衰疾病的中藥治療藥效評(píng)估提供新方法。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R541.6;TP212.3

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