本文關鍵詞：艾拉莫德對類風濕關節(jié)炎患者骨代謝作用的研究

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【摘要】：類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節(jié)破壞及關節(jié)功能障礙為特點的自身免疫性炎性疾病。RA的發(fā)病機制并未完全明確,但已發(fā)現(xiàn)有多種細胞、炎性因子以及信號通路參與其中。RA重要的特征之一就是關節(jié)損害,由骨代謝異常所致。骨代謝的平衡由骨吸收和骨形成控制,而骨吸收和骨形成可以被多種細胞因子及信號通路所調(diào)節(jié)。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B,RANK)/骨保護素(osteoprotegerin,OPG)系統(tǒng)以及Wnt信號通路是兩條調(diào)節(jié)RA骨代謝的重要通路。RANKL是腫瘤壞死因子家族的成員,它可以與它的受體RANK結合,來促進破骨細胞的分化和活化。OPG作為RANKL的誘騙性受體,可以通過阻斷RANKL和RANK的相互作用起到骨保護作用。RANKL的過表達和OPG的表達不足可以促進RANKL介導的骨破壞。RA患者血清中RANKL/OPG比例較健康人和骨關節(jié)炎患者升高,它可以作為預測未來關節(jié)破壞進展的標志物,并且在治療后出現(xiàn)下降。Wnt信號通路也是骨代謝的重要調(diào)節(jié)因素。Wnt信號通路的激活可以促進成骨細胞分化與活化。Dickkopf-1(DKK-1)是Wnt通路的重要的可溶性抑制因子,它可以通過阻斷Wnt信號通路抑制成骨細胞的活性。DKK-1作為骨量改變和關節(jié)重塑的調(diào)節(jié)因子,在RA患者血清中水平較健康人升高,并且與炎癥和骨破壞相關,在經(jīng)過生物改善病情抗風濕藥(biological disease modifying antirheumatic drugs,bDMARDs)治療后下降。I型膠原羥基端肽(C-telopeptide of type I collagen,CTX-I)和I型膠原氨基端前肽(procollagen type I N-terminal propeptide,PINP)是廣泛應用的骨代謝標志物。CTX-I是骨破壞的敏感和特異的標志物。與之相反,PINP是骨形成的標志物。艾拉莫德,一種對RA有治療作用的新型DMARD,可以有效抑制疾病活動,并且對骨代謝表現(xiàn)出積極的保護作用。目前已有研究表明艾拉莫德可以促進成骨細胞的分化和抑制破骨細胞分化,并且可以抑制關節(jié)區(qū)RANKL的表達。然而,艾拉莫德的具體骨保護作用機制尚未完全明確,尤其是對ra患者血清中骨代謝調(diào)節(jié)因子及標志物的影響以及對ra患者成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocytes,fls)在白細胞介素-1(interleukin-1,il-1)誘導下高表達的rankl和opg的作用仍有待研究。目的:探討艾拉莫德對ra患者血清中骨代謝調(diào)節(jié)因子(rankl、opg、dkk-1)及標志物(ctx-i、pinp)的影響以及對ra患者fls在il-1誘導下高表達的rankl和opg的作用,進一步揭示艾拉莫德在骨代謝中起到的作用,以便更好地指導ra患者的臨床治療。方法:收集67名應用艾拉莫德(25mg,每日2次口服)或甲氨蝶呤(methotrexate,mtx,10mg,每周1次口服)或聯(lián)合應用艾拉莫德(25mg,每日2次口服)及mtx(10mg,每周1次口服)的ra患者在治療前基線期,治療6個月和治療12個月的臨床資料、實驗室數(shù)據(jù)、影像學評分。所有患者符合2010年美國風濕病學會(americancollegeofrheumatology,acr)/歐洲抗風濕病聯(lián)盟(europeanleagueagainstrheumatism,eular)制定的分類標準及評分系統(tǒng)。同時收集ra患者血清,應用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)和電化學發(fā)光免疫分析法(electrochemiluminescenceimmunoassay,eclia)檢測血清中rankl、opg、dkk-1、ctx-i、pinp的含量。收集3名行膝關節(jié)置換術的ra患者的滑膜組織,分離fls并培養(yǎng)�；颊呔�1987年acr制訂的ra分類標準。fls傳代至4-8代時用于試驗。fls在含有10ng/mlil-1β以及分別含有5、10或20μg/ml艾拉莫德,或100nmmtx,或20μg/ml艾拉莫德聯(lián)合100nmmtx的培養(yǎng)體系中孵育48小時,收集細胞培養(yǎng)上清及fls。用elisa法檢測fls培養(yǎng)上清液中opg含量,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qpcr)和免疫印跡法檢測fls中rankl和opg信使核糖核酸(messengerribonucleicacid,mrna)以及蛋白的表達。結果:對治療前后28個關節(jié)的疾病活動性評分(diseaseactivityscore28,das28)進行分析,發(fā)現(xiàn)三組ra患者在治療6個月及12個月時,與基線期相比,das28均顯著下降(均p0.001)。盡管在治療前基線期三組患者das28水平無差別,在治療6個月時,與艾拉莫德組和mtx組相比,聯(lián)合用藥組das28水平更低(均p0.05),在治療12個月時三組das28水平無明顯差異�；�期所有血清骨代謝調(diào)節(jié)因子和標志物在三組ra患者間均無顯著性差異。對rankl來說,在治療6個月和12個月時,三組rankl水平均顯著下降(均p0.01),并且聯(lián)合用藥組在治療6個月時對rankl的抑制作用較其他兩組明顯(均p0.05),在治療12個月時三組間已無差異。rankl/opg比值的變化與rankl的變化趨勢相似。不同的是,雖然在治療12個月時三組rankl/opg比例與基線期相比都出現(xiàn)顯著性下降(均p0.001),但在治療6個月時,只有聯(lián)合用藥組rankl/opg比值顯著下降(p0.001),另兩組rankl/opg比值與基線期相比沒有顯著性差異。血清opg水平和dkk-1水平在三組中均不隨治療而改變。三組血清pinp水平在治療后均有所上升,但只在治療后12個月時差異顯著(分別為艾拉莫德組p0.01,甲氨蝶呤組p0.05,聯(lián)合用藥組p0.001)。對于ctx-i,只有聯(lián)合用藥組在治療6個月及12個月時表現(xiàn)出顯著性下降(分別為p0.05,p0.001),而其他兩組沒有顯著性差異。對das28評分以及血清中骨代謝調(diào)節(jié)因子和標志物在治療前后的改變量進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)治療6個月時,艾拉莫德組△das28-紅細胞沉降率(erythrocytesedimentationrate,esr),△das28-c反應蛋白(c-reactiveprotein,crp)與△ctx-i呈正相關(r=0.557,p0.01;r=0.652,p0.01),而△das28-esr與△pinp呈負相關(r=-0.443,p0.05)。治療12個月時,聯(lián)合用藥組△das28-esr,△das28-crp與△pinp呈負相關(r=-0.433,p0.05;r=-0.554,p0.01)。影像學評分發(fā)現(xiàn)治療6個月及治療12個月時,三個組ra患者之間影像學進展并不存在差異。il-1β誘導的ra患者的fls培養(yǎng)上清液中opg較未經(jīng)誘導組顯著增高(p0.05),但對艾拉莫德和mtx的作用無顯著反應。ra患者的fls經(jīng)過il-1β誘導后,RANKL和OPG的mRNA表達和RANKL mRNA/OPG mRNA比值均增加(分別為p0.01,p0.01,p0.05)。艾拉莫德和MTX對OPG mRNA的表達并無顯著作用。對于RANKL mRNA,艾拉莫德和MTX都可以顯著抑制其高表達(均p0.01)。另外,兩種藥物聯(lián)合應用較單藥應用表現(xiàn)出更強大的抑制作用(均p0.05)。RANKL mRNA/OPG mRNA比值與RANKL mRNA表達的變化趨勢相似,不同的是,對于RANKL mRNA/OPG mRNA比例,聯(lián)合用藥組只與MTX組比較有顯著性差異(p0.05),而與艾拉莫德組之間并無顯著性差異。RA患者的FLS經(jīng)過IL-1β誘導后,細胞內(nèi)OPG蛋白表達增高(p0.01),但是對艾拉莫德和MTX的作用無顯著反應。MTX與艾拉莫德(10和20μg/m L)均可抑制IL-1β誘導的RANKL高表達(均p0.01),且艾拉莫德的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性,20μg/mL的艾拉莫德較5和10μg/m L的艾拉莫德作用更強大(分別p0.01以及p0.05)。另外,兩種藥物聯(lián)合應用較兩種單藥作用表現(xiàn)出對RANKL更強大的抑制作用(MTX p0.01和艾拉莫德p0.05)。觀察RANKL/OPG比例也出現(xiàn)了與RANKL表達相似的變化趨勢。結論:1.艾拉莫德可以有效抑制RA的疾病活動,將疾病控制在中、低活動度。2.艾拉莫德可以有效促進骨形成,與MTX聯(lián)合作用可以有效抑制骨吸收。RA患者經(jīng)過艾拉莫德治療6個月及12個月后血清中骨代謝調(diào)節(jié)因子RANKL得到抑制,12個月后RANKL/OPG比例下降。同時,艾拉莫德可以濃度依賴性地抑制FLS中RANKL的表達。艾拉莫德可以通過調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)以及抑制炎癥實現(xiàn)骨保護作用。3.艾拉莫德對血清中骨代謝調(diào)節(jié)因子DKK-1水平無影響,其骨保護作用并非通過調(diào)節(jié)由DKK-1介導的Wnt信號通路而實現(xiàn)。4.艾拉莫德對RA的治療作用、對關節(jié)破壞的保護作用、對骨代謝調(diào)節(jié)因子和標志物的作用與MTX相似,聯(lián)合應用艾拉莫德和MTX較單藥應用展現(xiàn)出更快及更強的效果。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R593.22

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本文編號：1277210