發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 04:09

  本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞對不同惡性表型腫瘤細(xì)胞的作用與機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景及意義間充質(zhì)干細(xì)胞(Mensenchymal Stem Cell, MSCs)是一類主要存在于全身結(jié)締組織或器官間質(zhì)的具有高度自我更新與多向分化能力的干細(xì)胞。由于其具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能,且有損傷與炎癥趨向性,可參與組織修復(fù)與再生,因此在多種疾病的治療研究中有廣泛的應(yīng)用前景。MSCs在腫瘤生物治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值也逐步為人們所認(rèn)識,主要是利用了MSCs的免疫抑制功能及腫瘤趨向性的特點(diǎn),例如在白血病患者骨髓移植與腫瘤靶向治療研究中MSCs可充當(dāng)輔助治療細(xì)胞或靶向治療載體。然而目前MSCs對不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不明確,因此MSCs在腫瘤治療應(yīng)用中的安全性仍存在爭議。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)與MSCs共培養(yǎng)后不同惡性表型腫瘤細(xì)胞基因型變化不同,其中多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)表達(dá)水平的變化存在顯著差異。PTB是一種在細(xì)胞內(nèi)部參與mRNA代謝過程的蛋白質(zhì),在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)高于正常組織,被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在基因靶點(diǎn)。目前PTB的表達(dá)水平對腫瘤惡性程度的影響存在爭議,可能與腫瘤細(xì)胞的類型和生物學(xué)特性有關(guān)。研究MSCs對不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制,并明確PTB在其中發(fā)揮的作用,可為MSCs在不同類型腫瘤治療研究中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也為PTB作為腫瘤治療基因靶點(diǎn)的有效性和安全性提供實(shí)驗(yàn)參考。研究目的1.明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的影響,探討MSCs對不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用及機(jī)制；并通過脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)對不同惡性表型乳腺癌細(xì)胞的體外作用進(jìn)行驗(yàn)證。2.明確BMSCs與不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞隔離共培養(yǎng)前后PTB及其相關(guān)信號通路中信號分子表達(dá)水平的變化,探討MSCs差異性調(diào)控不同惡性表型腫瘤細(xì)胞中PTB表達(dá)水平的機(jī)制；并通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲減技術(shù)研究PTB在不同惡性表型腫瘤細(xì)胞中的功能。研究方法1. BMSCs對不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用研究體外培養(yǎng)不同惡性表型人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29與HCT116,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；通過MTS法檢測細(xì)胞的增殖能力；利用transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力；運(yùn)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的克隆形成能力；并用real-timePCR定量檢測上皮類(E-cadherin)和間充質(zhì)類(Vimentin)細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá),鑒定HT29與HCT116細(xì)胞的生物學(xué)特性；再采用全骨髓血貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)健康志愿者髂骨骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMSCs),經(jīng)體外擴(kuò)增2代后分別與HT29和HCT116進(jìn)行隔離共培養(yǎng),在第3天和5天比較共培養(yǎng)組與對照組HT-29和HCT116的細(xì)胞形態(tài)、增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力以及腫瘤惡性相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)等指標(biāo)的差異,探討B(tài)MSCs對HT29和HCT116生物學(xué)特性的差異性調(diào)控作用。最后將HT29與HCT116分別與BMSCs在體外隔離共培養(yǎng)1周后注射至裸鼠皮下,比較各組細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤時(shí)間、成瘤體積和瘤體組織的分化程度等指標(biāo)的差別。2.PTB在BMSCs差異性調(diào)控HT29與HCT116中的功能研究通過real-time PCR與Western Blot的方法檢測PTB及其相關(guān)信號通路中上下游信號分子基因及蛋白表達(dá)水平的變化,明確HT29與HCT116分別與BMSCs共培養(yǎng)過程中PTB信號通路的變化；并用加尾法real-time PCR定量檢測相關(guān)miRNAs的表達(dá)水平,探討B(tài)MSCs差異性調(diào)控HT29和HCT116中PTB表達(dá)水平的機(jī)制。再通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲減技術(shù)敲低HT29和HCT116中PTB的表達(dá),檢測HT29和HCT116生物學(xué)特性的改變,再利用real-time PCR與westernblot的方法檢測EMT調(diào)節(jié)基因、腫瘤干性基因及腫瘤惡性相關(guān)的信號通路蛋白分子表達(dá)水平的變化,探討PTB在BMSCs差異性調(diào)控HT29與HCT116生物學(xué)特性中的功能。3. ADSCs對不同惡性表型乳腺癌細(xì)胞作用的體外研究體外培養(yǎng)不同惡性表型的乳腺癌細(xì)胞系MCF7(雌激素受體陽性細(xì)胞)與MDA-MB-231(三陰性乳腺癌細(xì)胞),通過比較兩種細(xì)胞的形態(tài)、增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力,鑒定其生物學(xué)特性；再從整形吸脂術(shù)中廢棄的脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cell, ADSCs),經(jīng)體外擴(kuò)增3代后分別與MCF7和MDA-MB-231隔離共培養(yǎng),在共培養(yǎng)第3天和第5天檢測共培養(yǎng)組與對照組細(xì)胞(單獨(dú)培養(yǎng)的MCF7/MDA-MB-231)形態(tài)、增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力以及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)標(biāo)志基因E-cadherin與N-cadherin的表達(dá)。研究結(jié)果1. BMSCs對不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用研究形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示HT29具有上皮類細(xì)胞的形態(tài)特征而HCT116呈現(xiàn)較強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞特征。細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定結(jié)果顯示HT29的增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力均顯著低于HCT116。BMSCs分別與HT29和HCT116體外隔離共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后可顯著促進(jìn)HT29的增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力,但對HCT116的影響不明顯；其機(jī)制可能是通過上調(diào)HT29中GSK3β、AKT、STAT3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HT29與BMSCs共培養(yǎng)后成瘤時(shí)間縮短,形成的腫瘤體積增大,且分化程度降低。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,HCT116與BMSCs共培養(yǎng)前后其體內(nèi)成瘤能力未見顯著改變。2.PTB在BMSCs差異性調(diào)控HT29與HCT116中的功能研究與BMSCs體外隔離共培養(yǎng)可顯著下調(diào)HT29中PTB基因與蛋白及其上游轉(zhuǎn)錄因子c-MYC及下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白CASP3基因的表達(dá),但對HCT116中PTB信號通路無顯著影響。此外,與BMSCs共培養(yǎng)后介導(dǎo)PTB表達(dá)下調(diào)的miRNAs (miR-133, miR-124, miR-339, miR-149)在HT29中的表達(dá)均顯著升高,但在HCT1 16中的變化不一致；敲低PTB可顯著抑制HT29的細(xì)胞增殖與克隆形成能力,上調(diào)其細(xì)胞侵襲能力,并降低HT29在裸鼠體內(nèi)的成瘤體積和瘤體組織的分化程度；其機(jī)制可能是通過改變FGFR2與CD44的選擇性剪接方式,上調(diào)Twist1和ALDH1基因的表達(dá),提高GSK3β和AKT蛋白的磷酸化水平,促進(jìn)Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain, NICD)的合成以及降低P27蛋白的水平來實(shí)現(xiàn)的；與HT29不同,敲低HCT116中PTB的水平可顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力,HCT116中ALDH1的基因表達(dá)水平以及NICD和磷酸化STAT3的蛋白表達(dá)水平也顯著下降。3. ADSCs對不同惡性表型乳腺癌細(xì)胞作用的體外研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示MCF7具有典型的上皮類細(xì)胞形態(tài)特征而MDA-MB-231呈現(xiàn)較強(qiáng)的間充質(zhì)類細(xì)胞特征；生物學(xué)特性鑒定結(jié)果顯示在體外培養(yǎng)條件下MCF7的增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力均顯著低于MDA-MB-231.與ADSCs隔離共培養(yǎng)后MCF7的細(xì)胞增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力均顯著升高,EMT標(biāo)志基因E-cadherin表達(dá)下降而N-cadherin的表達(dá)增高。此外,ADSCs對惡性表型高的MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力的影響不明顯。結(jié)論1. BMSCs可通過提高GSK3β、AKT、STAT3、ERK1/2的蛋白磷酸化水平激活相關(guān)通路,促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29的增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力,并降低其形成瘤體組織的分化程度,但對HCT116的作用并不明顯。提示BMSCs對不同惡性表型腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用不同,可誘導(dǎo)低惡性表型HT29細(xì)胞向高惡性表型細(xì)胞轉(zhuǎn)變,但對高惡性表型HCT116細(xì)胞的作用不明顯。2.在體外隔離共培養(yǎng)條件下BMSCs可顯著抑制HT29中PTB表達(dá)及相關(guān)的信號通路。敲減PTB可提高HT29的體外侵襲能力并降低其體內(nèi)成瘤后瘤體組織的分化程度,其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)FGFR2與CD44的選擇性剪接,促進(jìn)Twist1和ALDHl基因的表達(dá),增高P-GSK3β、p-AKT、NICD并降低P27的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。提示PTB表達(dá)的異常降低可能是低惡性表型HT29向高惡性表型轉(zhuǎn)變的一個(gè)“開關(guān)”,BMSCs可能通過抑制PTB相關(guān)信號通路促進(jìn)HT29惡性表型的增高。3.在體外隔離共培養(yǎng)條件下BMSCs對高惡性表型HCT116中PTB及相關(guān)信號通路無顯著影響。但敲減PTB可顯著抑制HCT116的細(xì)胞增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成和體內(nèi)成瘤能力,并降低腫瘤干性相關(guān)基因ALDH1和腫瘤惡性相關(guān)信號通路蛋白NICD與磷酸化STAT3的表達(dá)。提示PTB參與不同惡性表型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的信號通路不同并發(fā)揮不同作用,相應(yīng)BMSCs對于不同惡性表型的腫瘤細(xì)胞中PTB的調(diào)節(jié)作用也不同。4. ADSCs可通過誘導(dǎo)EMT的發(fā)生促進(jìn)低惡性乳腺癌細(xì)胞MCF7向高惡性表型腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,但對高惡性表型MDA-MB-231細(xì)胞的生物學(xué)特性影響不明顯。進(jìn)一步提示不同組織來源的MSCs可能通過不同的機(jī)制,差異性調(diào)控不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化；為不同類型腫瘤治療研究以及腫瘤術(shù)后組織重建研究中MSCs的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1277086