本文關鍵詞：華蟾毒精、土木香內(nèi)酯誘導人結(jié)腸癌細胞凋亡及其機制的研究

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【摘要】：結(jié)直腸癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤。在美國,結(jié)直腸癌的發(fā)病率占所有癌癥的第四位,死亡率占第二位。不同于西方一些國家結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐步降低,我國人群結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高并呈顯年輕化趨勢。因此研發(fā)高效低毒的抗癌新藥是降低結(jié)直腸癌死亡率的關鍵。近年來,分子靶向藥物成為治療癌癥的有效手段,與傳統(tǒng)放化療相比,分子靶向治療優(yōu)勢明顯。分子靶向藥物針對性地靶向腫瘤細胞,對正常組織影響小,可減輕毒副反應、提高治療效率。目前,雖然靶向藥物的研究取得了一定的進展,但同時也遇到很多困難,例如由于細胞內(nèi)的信號傳導實際為多靶點、多環(huán)節(jié)的調(diào)控過程,單靶點藥物只針對某一條細胞通路,腫瘤細胞最終會發(fā)生耐藥,導致腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移。因此,尋找有效的腫瘤特異性靶點并研發(fā)新藥,特別是具有多靶點、多作用機理的抗腫瘤藥物可能成為攻克癌癥的有效途徑。腫瘤細胞的新陳代謝速率高于正常細胞,因而承受著更大的氧化應激壓力。在腫瘤發(fā)展過程中,細胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平明顯上升。ROS可引起上百種類型的DNA氧化損傷,其中氧化核苷酸池中或DNA單鏈中的脫氧三磷酸鳥苷(d GTP)及脫氧三磷酸腺苷(d ATP)生成8-羥基脫氧三磷酸鳥苷(8-oxoguanine,8-oxo G)及2-羥基-2-脫氧三磷酸腺苷(2-OH-d ATP)是最常見的DNA氧化修飾,二者插入DNA中后進行的堿基切除修復和錯配修復可導致DNA單鏈大量缺口和斷裂,繼而引起DNA雙鏈斷裂、DNA損傷、細胞凋亡。腫瘤細胞為解決自身高水平ROS,研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞均高表達一種核苷酸焦磷酸酶——MTH1(mut T homolog 1),其表達量與腫瘤的惡性程度正相關。MTH1蛋白是Mut T同源酶,分布于細胞的線粒體和細胞核中,參與DNA損傷修復過程。MTH1能夠高效水解8-oxo G及2-OH-d ATP,從而防止氧化的核苷酸摻入DNA雙鏈。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞內(nèi)的MTH1充當了氧化核苷酸“清潔工”的作用,是維持腫瘤細胞生存、促進腫瘤發(fā)展所必須的,利用si RNA干擾MTH1正常功能后腫瘤細胞DNA受損、細胞凋亡。值得注意的是,正常細胞的存活并不依賴于MTH1的作用,敲除MTH1對正常細胞無影響�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,我們可以得出以下推論:升高腫瘤細胞ROS水平或者靶向抑制MTH1酶活性均可以使腫瘤細胞的氧化應激增大,插入DNA中的氧化核苷酸增多,造成DNA損傷、腫瘤細胞凋亡。中藥抗腫瘤具有悠久歷史,但多數(shù)中藥成分復雜,包含無效成分甚至有毒成分,因而提取其有效成分并進一步加以分離、純化得到有效單體是中藥研究領域的一項重要內(nèi)容。在中藥單體中篩選具有抗癌作用的先導化合物并對其進行結(jié)構(gòu)修飾和劑型改造也是抗癌新藥研發(fā)的重要手段�；谝陨侠碚摵脱芯砍晒�,我們制定了本研究的技術(shù)路線:首先,應用體外高通量酶學實驗在中藥單體庫中篩選具有抑制MTH1酶活性的單體;之后選取人結(jié)腸癌細胞作為研究模型,在細胞水平驗證所篩選出的中藥單體通過抑制MTH1,使腫瘤細胞內(nèi)大量8-oxo G累積、DNA損傷、結(jié)腸癌細胞凋亡;最后,利用計算機模擬分子對接技術(shù)進一步證明所選單體與MTH1的結(jié)合。在本研究中,我們通過對175種中藥單體進行酶學篩選,發(fā)現(xiàn)華蟾毒精具有很好的MTH1抑制作用,其酶學反應半抑制濃度IC50為11.51μm。在細胞實驗中,我們發(fā)現(xiàn)華蟾毒精可抑制人結(jié)腸癌細胞SW480的增殖、誘導細胞凋亡。用相同劑量的華蟾毒精處理結(jié)腸癌細胞和人正常細胞,結(jié)果顯示華蟾毒精對SW480細胞具有明顯的殺傷作用而對正常細胞無影響。華蟾毒精引起SW480細胞周期G1/G0期阻滯,WB檢測p21Cip/WAF1表達升高。免疫熒光檢測及單細胞凝膠電泳實驗證明華蟾毒精處理后的SW480細胞8-oxo G含量顯著升高,DNA損傷標志物53BP-1蛋白表達量增加。接下來我們檢測了華蟾毒精對SW480細胞的線粒體膜電位以及細胞內(nèi)ROS水平的影響,結(jié)果顯示華蟾毒精可引起線粒體膜電位降低、ROS升高。綜合以上實驗結(jié)果我們得出結(jié)論:華蟾毒精通過靶向抑制MTH1活性和升高細胞ROS水平的雙重抗腫瘤作用機制引起結(jié)腸癌細胞凋亡。為進一步證明華蟾毒精與MTH1的結(jié)合,我們應用計算機模擬分子對接技術(shù)對MTH1與華蟾毒精進行了分子對接,結(jié)果顯示二者通過氫鍵和Pi-Pi共軛作用形成穩(wěn)定的復合物,且華蟾毒精結(jié)合在MTH1的催化位點處。接下來,我們應用計算機模擬技術(shù)對華蟾毒精的藥代動力學、藥效學及毒理學性質(zhì)進行預測和分析,發(fā)現(xiàn)華蟾毒精具有較好的成藥性。在酶學篩選實驗中我們發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯雖不具備MTH1抑制作用,但亦能引起SW480細胞內(nèi)8-oxo G增多、DNA損傷。進一步實驗結(jié)果表明土木香內(nèi)酯可誘導結(jié)腸癌細胞凋亡、細胞周期阻滯在G1/G0期、p21Cip/WAF1蛋白表達量升高,但對人正常細胞無影響;土木香內(nèi)酯可引起SW480細胞線粒體膜電位降低、ROS水平升高;土木香內(nèi)酯處理后的SW480細胞線粒體通路蛋白表達發(fā)生了變化,抗凋亡蛋白Bcl-2表達量降低、促凋亡蛋白Bax以及活化的caspase-3表達量增多。實驗結(jié)果表明:土木香內(nèi)酯可升高SW480細胞ROS水平、通過內(nèi)源性途徑激活線粒體凋亡通路誘導SW480細胞凋亡。本文對華蟾毒精和土木香內(nèi)酯誘導人結(jié)腸癌細胞凋亡的分子機制進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)華蟾毒精作為靶向MTH1抑制劑的同時兼有升高ROS的作用。對比只有升高ROS作用的土木香內(nèi)酯對SW480細胞的IC50為21.63μM,華蟾毒精的IC50極低,僅為110.3n M,二者相差約200倍。計算機模擬研究證明華蟾毒精結(jié)合于MTH1的催化位點,并預測其具有較好的成藥性。綜上所述,華蟾毒精和土木香內(nèi)酯均能夠抑制人結(jié)腸癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡,是兩種可進一步研發(fā)的抗癌藥物,本研究為其成藥研究及臨床應用提供了技術(shù)方法和理論基礎。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.3

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