本文關(guān)鍵詞：腺苷A2A受體激動(dòng)劑及小白菊內(nèi)酯在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎中的免疫調(diào)節(jié)作用的研究

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【摘要】：研究背景:吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)累及周圍神經(jīng),是一組急性炎性周圍神經(jīng)病,特征表現(xiàn)為急性起病,雙側(cè)肢體對(duì)稱性、上行性、弛緩性癱瘓,可伴有或不伴有感覺障礙。周圍神經(jīng)病理檢查可見炎性細(xì)胞浸潤、脫髓鞘及軸索變性。GBS的發(fā)病機(jī)制尚不明確,無特異的有效的治療藥物,目前主要的治療措施為血漿置換(plasma exchange,PE)及靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin injection,IVIG)。血漿置換及IVIG價(jià)格較貴,血漿置換使用條件高,免疫球蛋白為血液制品來源有限,限制了臨床應(yīng)用。因此有待我們探索GBS的發(fā)病機(jī)制及新的治療方案。腺苷是體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物,胞外的腺苷水平在病理?xiàng)l件下迅速升高。目前發(fā)現(xiàn)的腺苷受體有四型,A1受體、A2A受體、A2B受體及A3受體。A2A受體為G蛋白偶聯(lián)受體。A2A受體激活后,能夠抑制中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的炎癥反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)是GBS的動(dòng)物模型,廣泛用于GBS發(fā)病機(jī)制的探究及篩選新的治療方案。盡管A2A受體激活的抗炎作用在多個(gè)研究中證實(shí),但是在EAN中的作用目前尚無報(bào)道。研究目的:探究A2A受體激活對(duì)EAN的免疫調(diào)節(jié)作用。研究方法:1.EAN動(dòng)物模型的誘導(dǎo)及癥狀觀察用提取分離的來自牛馬尾的牛周圍神經(jīng)髓鞘(bovine peripheral myelin,BPM)免疫Lewis大鼠,免疫后每天觀察大鼠的肢體活動(dòng)并稱重,并對(duì)大鼠病情評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0=未發(fā)病;1=尾癱;2=中度后肢癱;3 =嚴(yán)重后肢癱;4 =四肢癱;5 =死亡。2.EAN動(dòng)物模型的分組及干預(yù)將EAN模型隨機(jī)分為2組:治療組和對(duì)照組。于免疫后的第5天開始給予腹腔注射A2A受體激動(dòng)劑CGS21680(lmg/kg)或者相同體積的生理鹽水。EAN模型每天給藥一次。在免疫后的第17天,處死大鼠,獲取血清、坐骨神經(jīng)及腹股溝淋巴結(jié)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌、膜表面分子表達(dá)及淋巴細(xì)胞亞型研磨腹股溝淋巴結(jié)獲取單個(gè)核細(xì)胞懸液,分別用熒光素標(biāo)記的CD3、CD4、CD8、CD161a、CD80、CD86、CD103、CD19、γδTCR抗體標(biāo)記細(xì)胞膜表面分子,用熒光素標(biāo)記的IL-10、IL-4、IL-17A、TNF-α、IFN-γ抗體標(biāo)記胞內(nèi)細(xì)胞因子,CD4和Foxp3抗體標(biāo)記調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg),CD4和CXCR5抗體標(biāo)記濾泡輔助性T細(xì)胞(follicularhelperTcells,Tfh),用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞預(yù)先用羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)染色,后在 ConA 或者 P0 肽段(180-199)的刺激下培養(yǎng)增殖,3天后收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖。5.ELISA檢測細(xì)胞增殖上清中IL-2水平淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞在P0肽段(180-199)的刺激下培養(yǎng)增殖,3天后收集培養(yǎng)上清,用大鼠IL-2 ELISA檢測試劑盒檢測上清中IL-2水平。6.ELISA檢測血清中抗體IgG及IgG亞型水平用P0肽段(180-199)包被96孔板,ELISA方法檢測大鼠心臟血血清中的特異抗體IgG及抗體亞型IgG1、IgG2a、IgG2b的水平。7.組織切片檢測周圍神經(jīng)炎性細(xì)胞浸潤及脫髓鞘大鼠坐骨神經(jīng)用多聚甲醛固定脫水包被后,制作石蠟切片,HE染色檢測神經(jīng)組織炎性細(xì)胞浸潤,用CD68抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞,免疫組化染色檢測巨噬細(xì)胞浸潤,Luxol fast blue染色檢測周圍神經(jīng)髓鞘脫失情況。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用GraphPad Prism 6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,臨床評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)分析,其他數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析,設(shè)定p0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果:1.A2A受體激動(dòng)劑CGS21680促進(jìn)EAN發(fā)病與對(duì)照組相比,CGS21680干預(yù)的大鼠發(fā)早、病情重、恢復(fù)晚、體重下降明顯,臨床評(píng)分在免疫后的第11、13和14天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,體重在免疫后的第10、12、13、14天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.A2A受體激動(dòng)劑CGS21680促進(jìn)坐骨神經(jīng)炎性細(xì)胞浸潤及脫髓鞘坐骨神經(jīng)切片染色顯示,與對(duì)照組相比,CGS21680干預(yù)組的浸潤的巨噬細(xì)胞更多,脫髓鞘程度更明顯。3.A2A受體激動(dòng)劑CGS21680干預(yù)升高血清中抗P0肽段抗體ELISA檢測顯示,CGS21680干預(yù)的大鼠血清中的抗PO肽段抗體IgG、IgG1和IgG2a的水平高于對(duì)照組。4.A2A受體激動(dòng)劑CGS21680抑制Th1和Th17細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制體外淋巴細(xì)胞的增殖及IL-2的產(chǎn)生流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子顯示CGS21680干預(yù)組的IFN-γ、TNF-α及IL-17的表達(dá)較對(duì)照組低,干預(yù)組的淋巴細(xì)胞增殖及IL-2的產(chǎn)生顯著低于對(duì)照組。5.A2A受體激動(dòng)劑CGS21680干預(yù)后減少了 Treg細(xì)胞,增加了 Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞與對(duì)照組相比,流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CGS21680干預(yù)后,引流淋巴結(jié)中的Treg細(xì)胞比例減少,Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞比例增加。6.A2A受體激動(dòng)劑CGS21680促進(jìn)CD86和MHC的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,CGS21680干預(yù)后,表達(dá)CD86和MHCⅡ細(xì)胞的比例及平均熒光強(qiáng)度都高于對(duì)照組。結(jié)論:A2A受體激活可加重EAN病情。A2A受體激動(dòng)劑CGS21680促進(jìn)周圍神經(jīng)炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘。A2A受體激動(dòng)劑CGS21680抑制Th1和Th17細(xì)胞,同時(shí)也減少了 Treg細(xì)胞,增加了 Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞,促進(jìn)了自身抗體的產(chǎn)生。研究背景:小白菊內(nèi)酯(Parthenolide,PAR)是從植物小白菊中提取的倍半萜內(nèi)酯,研究表明PAR具備強(qiáng)的抗炎活性。體外實(shí)驗(yàn)顯示PAR能夠抑制T細(xì)胞的增值,抑制T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。PAR的抗炎活性主要?dú)w結(jié)于對(duì)NF-κκB信號(hào)通路的抑制,PAR能夠干擾NF-κB信號(hào)通路上的多個(gè)分子,因此,PAR也經(jīng)常作為NF-κB的抑制劑來應(yīng)用。NK-κB是一種進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子,最初在B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),結(jié)合于κ鏈基因附近,因此得名為 NF-κB(nuclear factor binding near the κ light-chain gene in B cells)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)NF-κB幾乎表達(dá)于哺乳動(dòng)物的所有細(xì)胞中,參與細(xì)胞的增值、分化、遷移及存活。NF-κB在免疫反應(yīng)中有重要作用,感染、應(yīng)激、細(xì)胞因子等多種刺激均會(huì)誘導(dǎo)NF-κB的激活。在多發(fā)硬化患者及多發(fā)硬化動(dòng)物模型-實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(experimental autoimmune encephalitis,EAE)-的腦組織均可檢測到NF-κB的激活。在吉蘭-巴雷綜合征的動(dòng)物模型-實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)的坐骨神經(jīng)中,也檢測到了 NF-κB信號(hào)通路的激活。此外,也有報(bào)道顯示PAR能夠直接抑制caspase-1的活性,抑制炎性小體的激活,進(jìn)而抑制IL-1釋放。PAR抗炎作用在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、動(dòng)脈粥樣硬化和腦梗死的動(dòng)物模型中都得到證實(shí),但是PAR在神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病中的作用尚無報(bào)道。研究目的:探究PAR對(duì)EAN中的免疫調(diào)節(jié)作用。研究方法:1.EAN動(dòng)物模型的誘導(dǎo)及癥狀觀察用提取分離的來自牛馬尾的牛周圍神經(jīng)髓鞘(bovine peripheral myelin,BPM)免疫Lewis大鼠,免疫后每天觀察大鼠的肢體活動(dòng)并稱重,并對(duì)大鼠病情評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0 =未發(fā)病;1=尾癱;2 =共濟(jì)失調(diào)或者輕度后肢癱;3 =中度后肢癱;4 =嚴(yán)重后肢癱;5 =四肢癱;6 =瀕死;7 =死亡。2.EAN動(dòng)物模型的分組及干預(yù)將EAN模型隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、小劑量治療組的大劑量治療組。于免疫后的第5天開始給予腹腔注射PAR(小劑量組為2mg/kg,大劑量組為8mg/kg),對(duì)照腹腔注射相同體積的溶劑。EAN模型每天給藥一次。分別于在免疫后的第10天和第14天,各處死一批大鼠,獲取心臟血血清、坐骨神經(jīng)及腹股溝淋巴結(jié)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子表達(dá)及CD4+T細(xì)胞亞群研磨腹股溝淋巴結(jié)獲取單個(gè)核細(xì)胞懸液,用熒光素偶聯(lián)的抗體標(biāo)記后,流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi) TNF-α、IFN-γ、IL-17 的產(chǎn)生,檢測 Th1(CD4+IFN+),Th17(CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)的比例。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞用凋亡試劑盒染色后,流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比例。5.ELISA檢測血清中IL-1β水平大鼠血清中IL-1β的水平用大鼠IL-1β檢測試劑盒檢測。6.坐骨神經(jīng)切片染色大鼠坐骨神經(jīng)固定脫水包埋后,制成石蠟切片,HE染色后觀察炎性細(xì)胞浸潤情況。7.體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)獲取免疫后第8天的大鼠的腹股溝淋巴結(jié)的單個(gè)核細(xì)胞,CFSE染色后,在體外分別用ConA和BPM刺激增殖,同時(shí)加入不同濃度的PAR,3天后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖,上清中的IL-17A和TNF-α水平用ELISA檢測。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用GraphPad Prism 6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,臨床評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)分析,其他數(shù)據(jù)采用ANOVA檢驗(yàn)分析,設(shè)定p0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果:1.在體外PAR抑制淋巴細(xì)胞增值和細(xì)胞因子的產(chǎn)生體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,PAR能夠顯著抑制淋巴細(xì)胞的特異性及非特異性的細(xì)胞增值,并且顯著抑制細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和TNF-α,該抑制作用與PAR濃度成正相關(guān)。2.PAR在早期抑制EAN的誘導(dǎo)發(fā)病,在晚期妨礙EAN的恢復(fù)EAN的早起誘導(dǎo)階段,免疫后的第11、12、13天,大劑量治療組的臨床評(píng)分較對(duì)照組低,小劑量組與對(duì)照組無顯著差異;在疾病高峰即免疫后第14天后,大劑量組與對(duì)照組無顯著差異,第16、17和18天,小劑量組的臨床評(píng)分較對(duì)照組高。3.在 EAN 早期,PAR 抑制 TNF-α、IFN-γ、IL-17 和 IL-1β 的產(chǎn)生,減少 Th1 和 Th17細(xì)胞的比例免疫后的第10天,流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測結(jié)果顯示,大劑量的PAR能夠抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17和IL-1β的產(chǎn)生,減少Th1和Th17細(xì)胞的比例,對(duì)Treg細(xì)胞無顯著影響。小劑量PAR抑制IL-1β的產(chǎn)生,但是對(duì)其他細(xì)胞因子和T細(xì)胞亞群無顯著影響。4.在EAN晚期,PAR對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生和T細(xì)胞亞群無影響免疫后的第14天,再次檢測上述指標(biāo),結(jié)果顯示三組之間無明顯差異。5.在EAN晚期,PAR抑制MNCs的凋亡和Fas的表達(dá)免疫后的第10天和第14天,分別檢測淋巴結(jié)MNCs的凋亡和Fas、FasL的表達(dá),結(jié)果顯示在早期三組無差異,在晚期大劑量和小劑量PAR都能夠抑制MNCs凋亡和Fas的表達(dá)。6.PAR對(duì)外周神經(jīng)炎性細(xì)胞的浸潤無明顯作用坐骨神經(jīng)的組織切片染色觀察顯示,三組都有大量的炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PAR強(qiáng)的抗炎作用,但是EAN體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,PAR抑制早期EAN的誘導(dǎo),在晚期妨礙EAN病情的恢復(fù),PAR不適于神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病的治療。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R745.43

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Parthenolide attenuates LPS-induced activation of NF-κB in a time-dependent manner in rat myocardium[J];Journal of Biomedical Research;2012年01期

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本文編號(hào)：1274555