本文關(guān)鍵詞：化痰散結(jié)法干預(yù)Graves病小鼠甲狀腺腫大與功能亢進(jìn)的免疫調(diào)控研究

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【摘要】：Graves病(Gravesdisease,GD)是一種自身免疫性甲狀腺疾病,在西方國(guó)家發(fā)病率達(dá)0.5%～2%,國(guó)內(nèi)發(fā)病率為2%～3.0%,并有逐年上升的趨勢(shì)。GD特征主要為甲狀腺腫大和甲狀腺功能亢進(jìn),與免疫紊亂密切相關(guān)。導(dǎo)師認(rèn)為:甲腫為有形之物,屬中醫(yī)"痰濁",功能亢進(jìn)屬中醫(yī)"火旺",GD的基本病機(jī)為"痰火凝結(jié)于頸前"�；诖瞬C(jī)提出"化痰散結(jié)、清熱消癭"的治療思想,并構(gòu)建了以夏枯草、玄參、土貝母等為主藥的GD治療基本方法,經(jīng)20余年的臨床驗(yàn)證,具有良好的療效。相關(guān)研究先后獲得三次國(guó)家自然科學(xué)基金資助,本研究來源于導(dǎo)師國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目"化痰散結(jié)法對(duì)Graves病小鼠模型甲狀腺腫大與激素合成下游事件的影響"(項(xiàng)目批準(zhǔn)編號(hào):81373593),從GD甲狀腺腫大、甲狀腺功能亢進(jìn)及免疫紊亂三個(gè)方面開展化痰散結(jié)法的研究,以期探索三者之間的關(guān)系和化痰散結(jié)法的作用特點(diǎn)。目的研究化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠甲狀腺腫大及功能亢進(jìn)的影響,并從免疫紊亂、增殖與凋亡失衡、甲狀腺激素合成下游事件等方面探討其作用機(jī)制。方法1.GD小鼠模型制備及分組:將雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal)、空載病毒對(duì)照組(Ad-Control)和重組腺病毒組(Ad-TSHR289)3組,Ad-TSHR289組采用含有TSHR-A亞單位的重組腺病毒,對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行脛前肌肉注射免疫,分別于實(shí)驗(yàn)第1、4、7周進(jìn)行,共免疫三次,誘導(dǎo)GD小鼠模型,每次免疫誘導(dǎo)前均對(duì)重組腺病毒進(jìn)行侵染力檢測(cè)。Ad-Control組注射空載病毒,Normal組注射等體積PBS溶液,免疫方式與Ad-TSHR289組相同。第10周時(shí)檢測(cè)小鼠血清T4及TRAb,當(dāng)成模率大于70%后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將造模階段Normal組和Ad-Control組小鼠繼續(xù)保留,成模后的小鼠隨機(jī)分為3組:GD模型組(GD);化痰散結(jié)中藥組(HTSJ);甲巰咪唑組(MMI)。對(duì)HTSJ組小鼠采用化痰散結(jié)中藥干預(yù),MMI組選取甲巰咪唑干預(yù),其余組給予等體積蒸餾水,藥物劑量按照人與動(dòng)物藥物劑量換算得出,灌胃給藥4周后,留取各組小鼠血清、脾臟、甲狀腺組織樣本,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.GD小鼠模型甲狀腺分泌功能的測(cè)定:用放免法檢測(cè)各組小鼠血清T4與TRAb,觀察化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺功能的影響。3.GD小鼠模型甲狀腺組織形態(tài)觀察:稱量各組小鼠體重及甲狀腺重量,計(jì)算小鼠甲狀腺指數(shù)(甲狀腺重量/體重),采用體式顯微鏡觀測(cè)各組小鼠甲狀腺形態(tài)改變,采用光鏡觀測(cè)各組小鼠經(jīng)HE染色的甲狀腺組織結(jié)構(gòu)改變,采用電子透射電鏡觀測(cè)各組小鼠甲狀腺超微結(jié)構(gòu)的改變,觀察化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺形態(tài)的影響。4.GD小鼠模型甲狀腺激素合成下游事件的分子檢測(cè):采用RT-PCR法及Westen Blot法檢測(cè)各組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO與Tg基因及蛋白的表達(dá)改變,觀察化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺素合成過程的影響。5.GD小鼠模型甲狀腺細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè):采用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠甲狀腺細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)、凋亡特異性蛋白Fas/FasL、Bcl-2/Bax的改變,觀察化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺細(xì)胞增殖與凋亡的影響。6.GD小鼠模型脾臟淋巴細(xì)胞Treg/Th17檢測(cè):分析采用四色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組小鼠CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞和CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞在脾臟淋巴細(xì)胞中的比例,采用RT-PCR法檢測(cè)各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA與IL-17mRNA表達(dá)的改變,觀察化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型免疫紊亂的影響。結(jié)果1.成功制備GD小鼠模型:Ad-TSHR289組小鼠血清T4為230.16±41.01ng/ml,較Normal 組升高 152.90%(P=0.000);血清 TRAb 為 12.34±3.51u/l,較 Normal 組升高1423.46%(P=0.000)。所有Ad-TSHR289組小鼠的血清T4及TRAb均超過Normal組的正常上限,小鼠總成模率為100%。2.化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺分泌功能的影響:HTSJ組小鼠血清T4為181.46±47.69ng/ml,較G0組下降了18.73%(P=0.021);TRAb為10.55±2.37u/l,較G0組下降了 35.47%(P=0.000)。3.化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺形態(tài)學(xué)的作用:HTSJ組小鼠甲狀腺指數(shù)為(3.189±1.220)×10-4,較GD組下降了 41.69%(P=0.000),甲狀腺充血得到改善。甲狀腺濾泡腔內(nèi)的乳頭狀凸起減少,甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生及肥大得到改善,高柱狀細(xì)胞形態(tài)逐漸向扁平狀恢復(fù),濾泡腔內(nèi)的膠質(zhì)較GD組增加。甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)目減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池的擴(kuò)張減輕,線粒體腫脹緩解,線粒體嵴較GD組清晰,細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞膠質(zhì)滴數(shù)目較GD組減少。4.化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺激素合成下游事件的影響:HTSJ組小鼠甲狀腺細(xì)胞中的NISmRNA及蛋白表達(dá)分別下降78.80%(P=0.003)和45.97%(P=0.000);TPOmRNA 及蛋白表達(dá)分別下降 72.85%(P=0.000)和 66.24%(P=0.000);TgmRNA及蛋白表達(dá)分別下降81.06%(P=0.000)和62.79%(PP=0.000)。5.化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型甲狀腺細(xì)胞增殖與凋亡的影響:HTSJ組小鼠甲狀腺組織的PCNA陽(yáng)性的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞較GD組減少,Fas陽(yáng)性、FasL陽(yáng)性的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞較GD組增加,Bax陽(yáng)性的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞較GD組增加,Bcl-2陽(yáng)性的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞較GD組無(wú)明顯改變。6.化痰散結(jié)法對(duì)GD小鼠模型免疫功能的影響:HTSJ組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例較GD組上升73.62%(P=0.037);脾臟淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA的表達(dá)較GD組上升 186.67%(P=0.010),IL-17mRNA的表達(dá)下降了 71.27%(P=0.003)。結(jié)論1.化痰散結(jié)法能夠有效改善GD小鼠甲狀腺功能亢進(jìn),減輕甲狀腺腫大。2.化痰散結(jié)法的作用機(jī)制可能是通過上調(diào)GD小鼠CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例,升高Foxp3mRNA的表達(dá),降低IL-17mRNA的表達(dá),調(diào)節(jié)GD小鼠的免疫紊亂,減少TRAb的產(chǎn)生,從而:①降低甲狀腺素合成過程中NIS、TPO、Tg的表達(dá),達(dá)到減少甲狀腺素合成的目的;②抑制甲狀腺細(xì)胞增殖,加速甲狀腺細(xì)胞凋亡,達(dá)到減輕甲腫的目的。通過對(duì)GD小鼠甲狀腺腫大、甲狀腺功能亢進(jìn)以及免疫紊亂三方面的綜合調(diào)控,最終起到治療GD的目的。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R259

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本文編號(hào)：1273613