本文關鍵詞：DNA甲基化模式異常在PM2.5致肺癌過程中的作用

  更多相關文章： PM2.5 暴露情境 DNA甲基化 ROS-Akt-DNMT3B 肺癌

【摘要】：背景和目的:近年來,全國范圍內(nèi)空氣細顆粒物(Fine Particulate Mater,PM2.5)污染已嚴重影響到人們的生產(chǎn)生活,由PM2.5污染所導致的各種公眾健康問題已受到政府和人民越來越多的關注。流行病學研究已表明,PM2.5長期暴露可導致人群中肺癌發(fā)病風險和因肺癌死亡率不斷攀升。僅2015年,在我國因PM2.5污染導致的肺癌死亡人數(shù)就占全國肺癌總死亡人數(shù)的23.9%。2013年,國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)正式將PM2.5列為人類I類致癌物。目前,PM2.5引起肺癌的機制尚未完全清楚。闡明PM2.5的致癌機制將為制定有效的干預措施和進行PM2.5的風險評價與管理提供重要依據(jù)。隨著表觀遺傳學研究的不斷深入,大量研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中常涉及全基因組和/或特定基因的DNA甲基化狀態(tài)異常。人群流行病學資料亦證實PM2.5持續(xù)暴露可導致機體DNA甲基化模式改變。提示PM2.5誘導DNA甲基化模式異常可能是PM2.5致肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要環(huán)節(jié),但其急需機制研究加以證實與補充,同時PM2.5是如何誘導DNA甲基化模式異常仍需進一步研究。由于倫理學限制,現(xiàn)有研究多采用體外動物實驗或細胞實驗探索PM2.5引發(fā)肺癌的相關機制。然而,大多數(shù)體外研究在暴露劑量、暴露時間等實驗條件的選擇上很少基于現(xiàn)實暴露情境,簡單地認為PM2.5毒性效應是“量”的累積,常在高濃度急性暴露情境下探討PM2.5致癌的可能毒性機制,不利于問題的解釋和研究結(jié)論的外推。因此,基于真實暴露情境進行的機制研究,可真實和全面地反映PM2.5暴露過程中DNA甲基化變化及其在PM2.5致肺癌過程中的作用,有助于揭示PM2.5真實的致病機制。基于上述考慮,本研究利用BEAS-2B細胞,首次通過體外構(gòu)建兩種暴露模型,分別模擬現(xiàn)實生活中高濃度急性暴露和低濃度長期暴露兩種常見的暴露情境,系統(tǒng)性對比分析不同暴露情境下PM2.5毒性效應的差異及相關毒性機制。然后選用合適的暴露模型,分析PM2.5持續(xù)暴露過程中細胞全基因組甲基化狀態(tài)和P53基因DNA甲基化水平,探索PM2.5暴露引起DNA甲基化模式異常的相關分子機制,揭示DNA甲基化模式異常在PM2.5致肺癌過程中的作用,旨在為闡明PM2.5致肺癌的表觀遺傳學機制奠定基礎,同時亦為今后開展PM2.5致癌風險評估、修訂我國空氣質(zhì)量標準和制定有效的干預措施提供重要實驗依據(jù)。方法:首先,利用粒度儀、穩(wěn)定分析儀和透射電子顯微鏡(TEM)對采集到的PM2.5進行粒徑、穩(wěn)定性和形貌進行分析。然后,通過多路徑顆粒沉積模型(MPPD模型)基于現(xiàn)實暴露情境設計高劑量急性暴露(6μg/cm2,12μg/cm2,24μg/cm2,48μg/cm2,96μg/cm2,單次染毒BEAS-2B細胞24h)和低劑量重復暴露(1.5μg/cm2,3μg/cm2,6μg/cm2;重復暴露10d)兩種暴露模型。在兩種暴露模型中,分別采用CCK-8和LDH漏出率分析PM2.5染毒后的細胞毒性,通過TEM觀察PM2.5對細胞超微結(jié)構(gòu)的影響,利用CM-H2DCFDA熒光探針分析細胞內(nèi)ROS水平,采用彗星實驗檢測PM2.5對DNA的損傷情況,利用流式細胞術分析細胞周期分布以及細胞凋亡和壞死發(fā)生率,采用Western Blot檢測PM2.5對細胞DNA損傷修復、自噬、線粒體功能、炎性因子和表觀遺傳調(diào)控等相關蛋白表達的影響,采用化學發(fā)光法檢測細胞內(nèi)ATP水平,利用q RT-PCR分析PM2.5暴露后細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR狀態(tài)、P53 m RNA表達情況,采用比色法檢測細胞內(nèi)全基因組DNA甲基化水平變化,利用BSP分析P53啟動子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài),以及采用EMSA分析P53啟動子區(qū)域DNA與核蛋白結(jié)合情況。此外,還通過si RNA干擾、ROS清除、抑制劑等方法進行高劑量急性暴露模型中細胞壞死原因的探討和分析低劑量暴露模型中細胞內(nèi)ROS-Akt-DNMT3B信號通路的作用。結(jié)果:1.本研究所采用的PM2.5的平均粒徑為0.74±0.08μm,在培養(yǎng)基中具有良好的分散性,較少發(fā)生聚集沉淀。TEM顯示PM2.5組成復雜、形態(tài)各異。2.在高劑量急性暴露模型中,高濃度PM2.5(≥24μg/cm2)能明顯抑制細胞活力,增加細胞內(nèi)LDH漏出,誘導細胞內(nèi)ROS生成急劇增多,造成線粒體腫脹甚至空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等改變,導致細胞DNA嚴重損傷。同時,隨著暴露濃度的增加,PM2.5能磷酸化激活細胞內(nèi)P53和H2A.X,上調(diào)P21、PARP-1表達,但并未引起細胞周期阻滯、細胞凋亡和胞內(nèi)cleaved Caspase-3明顯變化,反而促進細胞壞死的發(fā)生率和細胞內(nèi)的IL-6水平升高。高濃度PM2.5暴露還能劑量依賴性激活m TOR-Beclin1-LC3B信號通路,誘導細胞自噬發(fā)生,上調(diào)細胞內(nèi)P62/SQSTM1蛋白水平。進一步分析細胞內(nèi)線粒體功能和ER-Stress相關分子變化,發(fā)現(xiàn)PM2.5雖能激活PGC-1α通路促進線粒體新生和功能,但細胞內(nèi)ATP水平卻隨著PM2.5濃度的增加而顯著降低,高濃度組(≥24μg/cm2)甚至不到對照組的30%。PM2.5能上調(diào)GRP78表達,但不能激活下游的UPR反應。在表觀遺傳調(diào)控方面,高濃度PM2.5短時間暴露可誘導細胞內(nèi)DNMT1、SIRT1表達增加,抑制細胞內(nèi)DNMT3B蛋白含量,而對DNMT3A表達無影響3.高濃度PM2.5急性暴露還能劑量依賴性增加細胞內(nèi)HO-1水平,并促使其富集于線粒體,抑制細胞色素C釋放。自噬抑制劑3-MA預處理和HO-1表達沉默后,能相互獨立地降低高濃度PM2.5導致的細胞壞死,促進細胞凋亡發(fā)生。4.在低劑量重復暴露模型中,≤6μg/cm2的PM2.5重復暴露10d后,不產(chǎn)生明顯的細胞毒性,但可誘導細胞內(nèi)ROS低水平上升,導致部分線粒體輕微腫脹,僅在高劑量組(6μg/cm2)出現(xiàn)明顯的DNA損傷。同時,隨著PM2.5濃度增加,細胞內(nèi)除H2A.X磷酸化激活外,cleaved PARP-1增加顯著,P53和P21反而劑量依賴性降低。低劑量PM2.5重復暴露可導致細胞發(fā)生S期阻滯,促進細胞內(nèi)cleaved Caspase-3表達增加,誘導細胞凋亡發(fā)生和細胞內(nèi)IL-6低水平增加。PM2.5重復暴露雖未引起m TOR-Beclin1-LC3B信號通路激活和P62/SQSTM1蛋白表達,但細胞內(nèi)卻出現(xiàn)降解性自噬小體和層狀小體。低劑量PM2.5重復暴露還能激活ER-Stress和下游的UPR反應,抑制NRF-1蛋白表達,誘導細胞內(nèi)ATP降低。另外,PM2.5重復暴露可抑制細胞內(nèi)DNMT1表達,增加DNMT3B細胞內(nèi)含量,對SIRT1和DNMT3A無影響。5.低劑量PM2.5重復暴露可誘導細胞內(nèi)ROS持續(xù)低水平增加。重復暴露5d后,PM2.5雖未引起明顯DNA損傷、細胞周期阻滯和細胞凋亡發(fā)生,卻能顯著減少細胞內(nèi)DNMT1蛋白表達,造成細胞全基因組甲基化水平降低,同時劑量依賴性上調(diào)細胞內(nèi)DNMT3B蛋白含量和磷酸化Akt水平。重復暴露10d后,隨著暴露濃度的增加,PM2.5可導致P53基因啟動子區(qū)域甲基化胞嘧啶位點逐漸增多,并顯著降低細胞內(nèi)P53 m RNA水平和P53蛋白含量。EMSA結(jié)果顯示PM2.5誘導的甲基化胞嘧啶堿基可顯著抑制核蛋白與DNA結(jié)合。通過ROS清除劑(NAC)和Akt抑制劑(LY294002)預處理后發(fā)現(xiàn),NAC和LY294002能顯著降低細胞內(nèi)的Akt磷酸化激活和DNMT3B蛋白表達水平,抑制由PM2.5暴露導致的P53基因啟動子甲基化水平增加,最終恢復細胞內(nèi)P53蛋白表達。結(jié)論:1.在兩種不同的暴露情境下,PM2.5暴露在的細胞活力、胞內(nèi)氧化水平、遺傳物質(zhì)損傷、細胞應激修復反應、能量供應、炎性水平、表觀遺傳調(diào)控以及細胞結(jié)局等方面產(chǎn)生的毒性效應差異明顯。研究結(jié)果表明高濃度PM2.5急性暴露,常誘發(fā)細胞嚴重損傷,超出細胞自身應激修復能力,導致細胞穩(wěn)態(tài)破壞,致使細胞出現(xiàn)不可控的“崩塌效應”,最終引起機體出現(xiàn)急性炎性癥狀發(fā)作等結(jié)局;而低劑量PM2.5長時間暴露,雖無明顯細胞毒性,但反復低氧化、低炎性刺激可促使機體內(nèi)細胞處于病理性適應狀態(tài),觸發(fā)許多跟低水平氧化應激相關的疾病發(fā)生等。因此,本研究結(jié)果提示“暴露情境”可能是決定PM2.5毒性效應及相應的致病機制的重要影響因素之一。2.高濃度PM2.5急性暴露,可通過誘發(fā)BEAS-2B細胞內(nèi)HO-1過度表達及線粒體富集,阻止線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放,從而抑制細胞凋亡。同時,高濃度的PM2.5在短時間內(nèi)上調(diào)細胞內(nèi)自噬活動,造成自噬流紊亂,觸發(fā)細胞自噬相關性壞死。因此,該暴露過程中PM2.5誘導產(chǎn)生的HO-1實則“助攻”細胞壞死的發(fā)生,發(fā)揮其負面效應。3.低劑量PM2.5重復暴露導致細胞內(nèi)ROS持續(xù)低水平增加,可能通過抑制細胞內(nèi)DNMT1蛋白表達造成細胞全基因組低甲基化。同時,PM2.5暴露還能通過激活細胞內(nèi)ROS-Akt-DNMT3B信號通路,誘導P53基因啟動子甲基化水平升高,進而導致P53基因轉(zhuǎn)錄表達水平降低,引起細胞內(nèi)P53蛋白水平降低。PM2.5誘導的全基因組低甲基化和P53啟動子高甲基化可能誘發(fā)并促進肺癌的發(fā)生。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2;R994.6

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 尚世強,俞錫林,洪文瀾,俞惠民,孫眉月;DETECTION OF BACTERIAL DNA BY PCR AND REVERSE HYBRIDIZATION IN THE 16s rRNA GENE[J];Journal of Zhejiang University Science;2000年02期

2 MA Wen li;DNA Diagnosis and Gene Therapy:Advances and Prospects in the 21st Century[J];深圳大學學報;2000年04期

3 葛學銘,陸應麟,付生法,范文紅,劉爽;A NOVEL HUMAN DNA SEQUENCE WITH TUMOR METASTASIS SUPPRESSIVE ACTIVITY[J];Chinese Journal of Cancer Research;2000年02期

4 曹暉,劉玉萍,小松かつ子,畢培曦,邵鵬柱;DNA Molecular Profiling:A New Approach to Quality Control of Chinese Drugs[J];Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine;2000年01期

5 ;DNA REPAIR CAPACITY IN LUNG CANCER PATIENTS[J];癌變.畸變.突變;2001年04期

6 黃力拉,朱剛勁;被拐賣及失蹤兒童采血驗DNA前的心理問題及對策[J];齊齊哈爾醫(yī)學院學報;2001年03期

7 安小惠 ,王一理 ,來寶長 ,耿一萍 ,司履生;CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS[J];Journal of Xi'an Medical University;2001年02期

8 ;A Study of PCR with DNA Extracted from Single Cell Isolated from Histological Sections[J];遵義醫(yī)學院學報;2001年01期

9 王軍陽,范桂香,勝利,袁育康;THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

10 董菁 ,成軍 ,王勤環(huán) ,施雙雙 ,王剛 ,斯崇文;CLONING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVERR EGENERATION FROM RAT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2002年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Michael J.Siefkes;Cory O.Brant;Ronald B.Walter;;A novel real-time XL-PCR for DNA damage detection[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學會學術年會論文摘要集[C];2011年

2 ;Hormonal Regulation and Tumorigenic Role of DNA Methyltransferase[A];2011中國婦產(chǎn)科學術會議暨浙江省計劃生育與生殖醫(yī)學學術年會暨生殖健康講習班論文匯編[C];2011年

3 Dongmei Zhao;Fan Jin;Yuli Qian;Hefeng Huang;;Expression patterns of Dnmtl and Dnmt3b in preimplantational mouse embryos and effects of in-vitro cultures on their expression[A];中華醫(yī)學會第十次全國婦產(chǎn)科學術會議婦科內(nèi)分泌會場（婦科內(nèi)分泌學組、絕經(jīng)學組、計劃生育學組）論文匯編[C];2012年

4 姜東成;蔣稼歡;楊力;蔡紹皙;K.-L.Paul Sung;;在聚吡咯微點致動下的DNA雜交行為[A];2008年全國生物流變學與生物力學學術會議論文摘要集[C];2008年

5 白明慧;翁小成;周翔;;聯(lián)鄰苯二酚類小分子作為DNA交聯(lián)劑的研究[A];第六屆全國化學生物學學術會議論文摘要集[C];2009年

6 張曄;杜智;楊斌;高英堂;;檢測外周血中游離DNA的應用前景(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第29屆學術年會暨首屆生物醫(yī)學工程前沿科學研討會論文集[C];2009年

7 周紅;鄭江;王良喜;丁國富;魯永玲;潘文東;羅平;肖光夏;;CpG DNA誘導全身炎癥反應綜合征的作用及其機制研究[A];全國燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會論文匯編[C];2004年

8 ;EFFECTS OF Ku70-DEFICIENT ON ARSENITE-INDUCED DNA DOUBLE STRAND BREAKS, CHROMOSOMAL ALTERATIONS AND CELL CYCLE ARREST[A];海峽兩岸第三屆毒理學研討會論文摘要[C];2005年

9 李經(jīng)建;冀中華;蔡生民;;小溝結(jié)合方式中的DNA媒介電荷轉(zhuǎn)移[A];第十三次全國電化學會議論文摘要集（下集）[C];2005年

10 ;The interaction between Levofloxacine Hydrochloride and DNA mediated by Cu~(2+)[A];湖北省化學化工學會2006年年會暨循環(huán)經(jīng)濟專家論壇論文集[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 袁滿;平安：把“領先”作為DNA[N];經(jīng)濟觀察報;2006年

2 舒放;編織一個DNA納米桶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

3 閆潔;英兩無罪公民起訴要求銷毀DNA記錄[N];新華每日電訊;2008年

4 何德功;日本制成診斷魚病的“DNA書”[N];農(nóng)民日報;2004年

5 本報記者 張巍巍;DNA樣本也能作假[N];科技日報;2009年

6 周斌偉　鄒巍;蘇州警方應用DNA技術一年偵破案件1887起[N];人民公安報;2011年

7 本報記者 楊天笑;揭秘“神探”DNA[N];蘇州日報;2011年

8 第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學部生物化學與分子生物學教研室教授 李福洋;破除法老DNA的咒語[N];東方早報;2011年

9 常麗君;DNA電路可檢測導致疾病的基因損傷[N];科技日報;2012年

10 常麗君;效率和質(zhì)量：“DNA制造業(yè)”兩大障礙被攻克[N];科技日報;2012年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 唐陽;基于質(zhì)譜技術的基因組DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武漢大學;2014年

2 池晴佳;DNA動力學與彈性性質(zhì)研究[D];重慶大學;2015年

3 胡璐璐;哺乳動物DNA去甲基化過程關鍵酶TET2的三維結(jié)構(gòu)與P暬蒲芯縖D];復旦大學;2014年

4 馬寅洲;基于滾環(huán)擴增的DNA自組裝技術的研究[D];南京大學;2014年

5 黃學鋒;精子DNA碎片的臨床意義：臨床和實驗研究[D];復旦大學;2013年

6 隋江東;APE1促進DNA-PKcs介導hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護中的作用[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

7 劉松柏;結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在DNA復制及細胞周期過程中的功能性研究[D];浙江大學;2015年

8 王璐;哺乳動物中親本DNA甲基化的重編程與繼承[D];中國科學院北京基因組研究所;2015年

9 齊文靖;染色質(zhì)改構(gòu)蛋白BRG1在DNA雙鏈斷裂修復中的作用及機制研究[D];東北師范大學;2015年

10 龍湍;水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 董洪奎;面向可視化納米操作的DNA運動學建模及誤差實時校正方法[D];沈陽理工大學;2014年

2 聞金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大環(huán)與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學;2015年

3 江懌雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學;2015年

4 高志森;比較外周游離循環(huán)腫瘤DNA與癌胚抗原監(jiān)測非小細胞肺癌根治術前后腫瘤負荷變化的初步研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

5 丁浩;血漿循環(huán)DNA完整性及多基因甲基化對肺癌診斷價值的研究[D];河北大學;2015年

6 王鵬;基于碳點@氧化石墨烯復合材料DNA生物傳感器的構(gòu)建及用于PML/RARα基因檢測[D];福建醫(yī)科大學;2015年

7 李海青;轉(zhuǎn)堿篷和鹽角草總DNA的耐鹽紫花苜蓿的選育[D];內(nèi)蒙古大學;2015年

8 李婷婷;小鼠DNA模式識別重要受體的分子結(jié)構(gòu)特征及其功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

9 劉瑞斯;抗癌藥物奧沙利鉑與DNA相互作用的原子力顯微鏡觀察研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

10 熊忠;芳香二肽與一價金屬離子間相互作用及DNA切割活性的研究[D];鄭州大學;2015年

，

本文編號：1273120