本文關鍵詞：藥物提高心肌干細胞治療急性心肌梗死療效的實驗研究

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【摘要】：目的:心肌干細胞(cardiac stem cells,CSCs)移植治療急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的療效受到存活率低和歸巢細胞數量少的限制�；|細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)與其特異性受體趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)構成的SDF-1/CXCR4軸在CSCs遷移的過程中發(fā)揮重要作用;而PODXL(podocalyxin-likeprotein1,podocalyxin)是CSCs細胞膜上的一個表面標記,被證實在細胞粘附和細胞間相互作用中發(fā)揮重要作用。本研究在體外缺氧無血清條件下模擬心肌缺氧微環(huán)境,研究阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)對小鼠CSCs的抗凋亡作用及可能發(fā)揮作用的分子機制。此外,本研究旨在探討ATV預處理能否增加CSCs表面CXCR4和PODXL的表達,并提高其遷移能力及與內皮細胞的粘附、穿越作用,進而改善AMI后心功能。方法:首先,分離培養(yǎng)小鼠CSCs,在缺氧無血清條件下用ATV處理12小時,應用流式細胞術和Hoechst 33342熒光染色觀察細胞凋亡,并利用Western blot方法檢測通路蛋白AMPK、mTOR的磷酸化水平。其次,設置不同ATV濃度梯度組及時間梯度組,通過流式細胞術檢測CSCs細胞表面CXCR4和PODXL的表達比例,確定ATV促進CSCs細胞表面CXCR4和PODXL表達的最佳濃度及時間。通過加入CXCR4的中和抗體及轉染PODXL-siRNA阻斷PODXL的表達進行機制研究,進行細胞遷移實驗,細胞粘附實驗和跨內皮遷移實驗評價各組CSCs細胞遷移能力,與內皮細胞的粘附和穿越能力。最后,在體實驗中將320只雌性C57小鼠隨機分為sham組,AMI組,口服強化ATV組,移植CSCs組,移植ATV預處理的CSCs(ATV-CSCs)組,口服強化ATV聯(lián)合移植ATV預處理的CSCs組(ATV+ATV-CSCs組),ATV預處理的轉染si-PODXL的CSCs 組(ATV-PODXL-SiRNA-CSCs)組、ATV 預處理的轉染 si-CXCR4 的 CSCs 組(ATV-CXCR4-SiRNA-CSCs)組。采用結扎冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周經頸靜脈注射各組處理的CSCs(2×105細胞/只),對照組動物注射等體積PBS。在干細胞移植后3天(基線)及4周(終點)分別行心臟超聲檢測、病理組織學及分子生物學檢測。結果:缺氧無血清條件引起明顯的細胞凋亡,ATV處理組細胞凋亡率顯著降低,且呈一定的濃度依賴性。ATV處理組AMPK磷酸化水平明顯升高,加入AMPK阻斷劑compound C可以顯著阻斷這種效應。ATV可以劑量依賴性促進CSCs表面CXCR4和PODXL的表達,在1μM ATV處理組和預處理12小時組表達比例最高。細胞遷移實驗顯示,加入CXCR4的中和抗體后CSCs的遷移能力明顯下降,ATV促進CSCs遷移的作用也被顯著抑制。細胞粘附實驗發(fā)現,ATV可以提高CSCs的粘附能力,而阻斷PODXL的表達,會顯著降低CSCs與細胞外基質成分的粘附能力,同時也會明顯抵消ATV促進CSCs細胞粘附的作用。在跨內皮遷移實驗中,與CSCs組相比,ATV預處理CSCs組穿越內皮細胞層的細胞數量顯著增加,而轉染PODXL-siRNA的CSCs組細胞數量則顯著減少。提示ATV促進CSCs與內皮細胞粘附及變形穿越內皮層的作用至少部分是通過PODXL蛋白介導的。在體實驗中,口服強化ATV聯(lián)合ATV預處理能夠促進CSCs的存活及歸巢,并從減輕炎癥細胞浸潤、抑制纖維化、減少心肌細胞凋亡及增加梗死周邊區(qū)血管新生等多個方面促進心肌修復,進而減小心肌梗死面積,減輕心臟重塑,改善心功能。結論:本研究結果表明ATV具有顯著的抗凋亡作用,可明顯提高CSCs在缺氧無血清條件下的存活率,其作用可能與AMPK/mTOR通路有關。使用ATV預處理的CSCs進行細胞移植,可以通過提高CSCs細胞表面CXCR4和PODXL蛋白的表達地促進其歸巢,改善AMI后心功能,聯(lián)合口服強化ATV和ATV預處理的CSCs可以進一步提高CSCs移植的療效,為提高干細胞移植療效提供了一種新的可能思路。目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后局部心肌微環(huán)境惡劣,導致心肌細胞大量丟失,我們課題組的前期研究發(fā)現,他汀可以對缺氧無血清條件下內皮細胞及心肌細胞有保護作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是調控細胞能量代謝的核心分子,它可以抑制下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性,在調節(jié)細胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用。本研究擬應用Wistar大鼠冠脈結扎制作AMI模型,給予AMPK抑制劑compound C和ATV進行干預,對比觀察他汀早期干預,對梗死后心肌微環(huán)境的影響,明確ATV對梗死周邊區(qū)心肌細胞的凋亡和自噬的調節(jié)作用及相關通路。方法:將100只8周齡200-220gWistar大鼠隨機平均分為5組:sham組,AMI組,口服強化ATV組(ATV組),口服強化ATV并注射compound C組(ATV+CC組),注射compound C組(CC組)。sham組手術線穿過前降支,但不結扎;其余各組開胸行前降支結扎,其中ATV(10mg/kg/d)和compound C(20mg/kg/w)從AMI模型制備當天開始給予至取材。為評價大鼠心功能的變化,我們在基線(AMI后3天)及終點(AMI后4周)時兩次進行超聲心動圖檢查來檢測左室功能。此外,通過ELISA,病理學檢測,Western blot等檢測炎癥因子水平,細胞凋亡,細胞自噬及通路蛋白的表達情況。結果:超聲數據顯示,與AMI組相比,口服ATV組的左室射血分數(LVEF)有明顯提高;組織病理學檢測顯示,與AMI組相比,口服ATV組的左室纖維化面積和炎性細胞浸潤明顯改善,炎癥因子表達水平降低;此外,口服ATV組凋亡細胞明顯減少,自噬陽性細胞明顯增加。加入AMPK抑制劑compound C后ATV的這些保護作用均被顯著抑制。Western blot結果顯示,口服ATV組p-AMPK的表達水平較其他幾組明顯上調,而p-p53和p-mTOR的水平則明顯下調。使用AMPK抑制劑compound C后,ATV+CC組和CC組p-AMPK的表達水平均顯著低于ATV組,與此相反的是,這兩組p-p53和p-mTOR的表達水平則顯著升高。而各組總AMPK,mTOR和p53的表達量卻沒有顯著差異。由此可知,口服ATV可以促進AMPK磷酸化,提高p-AMPK/AMPK的比例,降低p-p53/p53和p-mTOR/mTOR的比例。而加入compound C后,ATV對p53和mTOR磷酸化的調節(jié)作用也被顯著抑制。結論:本研究發(fā)現在大鼠急性心梗后4周,ATV可以通過AMPK/mTOR通路顯著促進細胞自噬,抑制細胞凋亡;并且通過激活AMPK/mTOR通路,ATV可以促進心肌存活,減輕炎癥反應,改善心功能。目的:在缺血再灌注損傷中,心臟微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)通過微循環(huán)控制、旁分泌及近分泌、屏障保護三大功能在局部心肌組織中發(fā)揮保護作用。同時CMECs在缺血再灌注損傷時較心肌細胞更加敏感,更易受到損傷。通心絡是一種由12種天然藥材構成的中藥復方制劑,具有保護內皮和防治心肌缺血再灌注損傷的功能。在本實驗中,我們通過CMECs體外缺氧/復氧損傷模型和通心絡處理,采取TMT(Tandem mass tag)標記的定量蛋白質譜方法檢測內皮細胞中多種蛋白的變化以及通心絡的調節(jié)作用,以便從整體水平系統(tǒng)研究缺氧/復氧損傷對于CMECs細胞內蛋白表達的影響以及通心絡發(fā)揮調節(jié)作用的相關機制。方法:以不同濃度的通心絡處理心臟微血管內皮細胞,缺氧2小時,復氧2小時,流式細胞術分析凋亡率以確定通心絡作用的最佳濃度。通過TMT標記的蛋白質譜法檢測心臟微血管內皮細胞在缺氧/復氧后細胞內發(fā)生變化的蛋白及通心絡處理后變化的蛋白,并通過基因本體論分析及文獻綜述發(fā)生變化的蛋白的功能及參與的通路。為進一步驗證差異蛋白功能,我們選取在缺氧/復氧和通心絡干預下有顯著變化的蛋白血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HMOX1)和血管生成素-2(angiopoietin-2 isoform c precursor,ANGPT2),分別進行抑制和過表達,通過細胞遷移實驗,成管實驗,增殖實驗等進行功能學驗證。結果:通心絡濃度依賴性地減少CMECs細胞凋亡,800μg/mL通心絡的抗凋亡作用最明顯。我們最終在三組中篩選出50個差異蛋白,并且進一步分析了這些蛋白的功能及通路。缺氧/復氧顯著改變CMECs細胞內蛋白的表達,而通心絡的干預會進一步改變細胞內蛋白的表達。與正常組相比,缺氧/復氧組下調了 30種蛋白的表達水平;而與缺氧/復氧組相比,通心絡干預組上調了 6種蛋白的表達,下調了 5種蛋白的表達。這些差異蛋白的功能主要包括細胞增殖,應激反應,調節(jié)細胞內代謝等。我們選取了一些在缺氧/復氧條件下發(fā)揮重要作用的蛋白如HMOX1,ANGPT2等進行進一步分析。在缺氧/復氧條件下,通心絡顯著抑制CMECs細胞凋亡,促進CMECs細胞增殖,遷移和成管。當同時加入HMOX1抑制劑TiiPPIX或過表達ANGPT2時,細胞凋亡數量明顯增加,發(fā)生增殖和遷移的細胞數量,成管長度及血管分支數均顯著減少。結論:TMT標記蛋白質譜檢測幫助我們從分子水平更深入的了解缺血再灌注損傷機制及通心絡的調節(jié)作用。我們確定了 CMECs細胞內與缺血再灌注損傷相關的50個差異蛋白,并分析了它們可能參與的多種功能調節(jié)及通路。缺血再灌注會顯著改變CMECs細胞內多種蛋白的表達,而通心絡干預會進一步改變這些因子的水平,提示通心絡可能通過下調炎癥因子的表達,抑制氧化應激因子,調節(jié)多種細胞內代謝活動,發(fā)揮微血管內皮保護作用。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22
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本文編號：1271875