本文關(guān)鍵詞：AMPA受體拮抗劑NBQX調(diào)控神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)減少癲癇發(fā)作的機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的癲癇是一種非常嚴(yán)重的腦功能紊亂,有多種發(fā)作類型和癲癇綜合征。神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu),環(huán)繞在小清蛋白陽性抑制性中間神經(jīng)元的周圍,在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用,有促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟過程中突觸可塑性形成。硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要的成分,它被認(rèn)為是一種內(nèi)源性突觸可塑性的生長因子。異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信號(hào)會(huì)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙,包括癲癇、中風(fēng)、阿爾茨海默病、精神分裂癥和成癮。植物凝集素中的紫藤多花凝集素(WFA)可利用N-乙酰氨基半乳糖殘基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)合,從而使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可視化。因此,我們?cè)谀壳暗难芯恐杏米咸俣嗷?WFA)標(biāo)記的神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評(píng)估。此外,三中細(xì)胞外基質(zhì)ECM的主要成分:聚集蛋白聚糖(aggrecan),腱糖白蛋-R(tenascin-R,)和神經(jīng)蛋白聚糖(neurocan),對(duì)于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成和穩(wěn)定起到了非常重要的作用。戊四唑,Y-氨基丁酸受體拮抗劑(PTZ),廣泛用于建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?模擬人類癲癇。高劑量的戊四唑(PTZ)可以增加興奮性谷氨酸遞質(zhì)和誘導(dǎo)全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。在目前的研究中,我們使用戊四唑(PTZ)在50mg/kg的劑量(IP)導(dǎo)致慢性癲癇發(fā)作,觀察NBQX抗癲癇作用以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參與作用。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的拮抗劑2,3-二羥基-6-硝基-7-氨磺酰-苯喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)在大鼠模型中可以降低自發(fā)性癇性的反復(fù)發(fā)作,但是NBQX在大鼠慢性癲癇模型中的對(duì)抗癲癇的機(jī)制還不清楚。神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)是一種特殊的神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì),圍繞在小清蛋白陽性的抑制性中間神經(jīng)元的周圍,同時(shí)在神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)育和突觸可塑性方面發(fā)揮了非常重要的作用。我們研究目的是應(yīng)用戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)慢性癲癇發(fā)作,觀察NBQX抗癲癇作用以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參與作用。用紫藤多花凝集素(WFA)標(biāo)記的神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評(píng)估,了解神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)在癲癇治療中的作用主要集中在神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)在癲癇治療中的作用,如果我們能夠通過研究確定這些分子通路在神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)中的作用,就可以通過調(diào)控這些通路來控制神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)的功能,進(jìn)而為癲癇的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)或者方向。研究方法(一)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒃趯?shí)驗(yàn)進(jìn)行之前12個(gè)小時(shí)之內(nèi)需要?jiǎng)儕Z動(dòng)物的飲食,不剝奪動(dòng)物的飲水。戊四唑組的動(dòng)物每天給予大鼠戊四唑腹腔注射(50mg/kg),連續(xù)28天的時(shí)間來建立慢性癲癇的動(dòng)物模型。對(duì)照組的大鼠給予生理鹽水注射,連續(xù)28天的時(shí)間。在第29天和第30天的時(shí)候進(jìn)行行為學(xué)的測(cè)試和神經(jīng)生化的分析。為了觀測(cè)NBQX在戊四唑誘導(dǎo)的慢性癲癇模型中的抗癲癇的作用。我們將大鼠分為四個(gè)組。生理鹽水腹腔注射建模+腹腔注射生理鹽水干預(yù)組;戊四唑(50mg/kg)腹腔注射建模+腹腔注射生理鹽水干預(yù)組;生理鹽水腹腔注射建模+腹腔注射NBQX組;戊四唑(50mg/kg)腹腔注射建模+腹腔注射NBQX組。在第30天結(jié)束后2天的時(shí)候進(jìn)行行為學(xué)的測(cè)試和神經(jīng)生化的分析。為了觀測(cè)在戊四唑誘導(dǎo)的慢性癲癇模型中ChABC在mPFC引起PNNs衰退。我們將大鼠分為四個(gè)組。生理鹽水腹腔注射+青霉素酶干預(yù)組(在第24天注射青霉素酶);ChABC腹腔注射+腹腔注射生理鹽水干預(yù)組(ChABC0.01 U/μg/side/0.5μl,在第24天注射);青霉素酶腹腔注射建模+戊四唑腹腔注射組(前28天注射戊四唑(50mg/kg),在第24天注射青霉素酶);戊四唑(50mg/kg)腹腔注射建模+腹腔注射ChABC組(前28天注射戊四唑(50 mg/kg),在第24天注射ChABC)。在第30天結(jié)束后2天的時(shí)候進(jìn)行行為學(xué)的測(cè)試和神經(jīng)生化的分析。為了觀察在戊四唑誘導(dǎo)的慢性癲癇模型中ChABC在mPFC引起PNNs衰退可以逆轉(zhuǎn)NBQX的抗癲癇作用。我們將經(jīng)過28天戊四唑(PTZ)注射的大鼠分為四個(gè)組�？瞻讓�(duì)照物(無NBQX)腹腔注射+青霉素酶干預(yù)組(在第24天在mPFC注射青霉素酶);ChABC+空白對(duì)照物腹腔注射干預(yù)組(ChAB在第24天注射);青霉素酶腹腔注射+NBQX腹腔注射組(在第24天注射青霉素酶,第29-31天注射NBQX);NBQX腹腔注射+腹腔注射ChABC組(在第24天將ChABC)注射至mPFC,在第 29-31 天將 ChABC+NBQX(20 mg/kg,i.p.)注射至 mPFC。在第 32天結(jié)束的時(shí)候進(jìn)行行為學(xué)的測(cè)試和神經(jīng)生化的分析。(二)誘導(dǎo)vr病的發(fā)作和行為分析戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作,可以表現(xiàn)為靜止期也就是延遲發(fā)作(S),小發(fā)作的持續(xù)時(shí)間期(s),大發(fā)作持續(xù)時(shí)間期(S),和戊四唑(PTZ)注射后1h癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度評(píng)分。輕微的癲癇發(fā)作被稱為孤立的肌陣攣和強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴有面部和前下肢肌肉的陣攣。而大癲癇發(fā)作的特點(diǎn)是持續(xù)的頭、頸、尾部的肌肉的強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。分?jǐn)?shù)是用來衡量癲癇發(fā)作按以下級(jí)發(fā)作的嚴(yán)重程度:Racine癇性發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):無驚厥1級(jí):咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐2級(jí):以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉的抽搐3級(jí):單側(cè)前肢的陣攣、抽搐4級(jí):雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起5級(jí):雙側(cè)后肢強(qiáng)直、身體背曲強(qiáng)直、跌倒在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,每只大鼠的發(fā)作行為記錄由一個(gè)視頻攝像機(jī)記錄。(三)組織樣品的制備在戊四唑(PTZ)最末次給藥30min后,處死試驗(yàn)大鼠,獲取試驗(yàn)大鼠的大腦。隨后,在-20℃的低溫恒溫器中,制作大約1mm厚度的內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(mPFC)冠狀位切片。獲取冠狀位切片大約距離前囟3.8mmm。將大鼠腦組織勻漿被裂解蛋白酶抑制劑RIIPA裂解液裂解后與電分散混合30分鐘。隨后,在4°C對(duì)大鼠腦組織勻漿進(jìn)行10,000×g容離心20分鐘以上。以上所有的程序都是在較低溫度下進(jìn)行(0-4℃)。采用BCA試劑盒測(cè)定各樣品的蛋白濃度。RIPA裂解液通過被稀釋的樣品達(dá)到蛋白質(zhì)的濃度的標(biāo)準(zhǔn)。(四)腦內(nèi)插管和顱內(nèi)注射用戊巴比妥鈉(60mg/kg,腹腔注射)麻醉大鼠,引導(dǎo)插管植入雙側(cè)1mm以上的立體坐標(biāo)的內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì):前/后(A/P),3.2mm;內(nèi)側(cè)/外側(cè)(M/L),±2.5mm;背/腹側(cè)(D/V),3.3mm,(28-30)。大鼠在顱內(nèi)注射前被允許休息恢復(fù)至少7天�？瞻讓�(duì)照物或ChABC通過顱內(nèi)注射用10ul漢彌爾頓注射器,聚乙烯-50注射器連接30號(hào)引導(dǎo)插管(Plastics One)到立體定向內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)的。ChAB C的注射劑量參考既往研究的劑量�？傮w的注射劑量為為0.5ul,每一側(cè)的注射時(shí)間在1min以上,為了更好地?cái)U(kuò)散,注射器被留在原地的至少1分鐘。在觀察評(píng)估行為測(cè)試后,將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(100 mg/kg,i.p)。在套管植入位置約30um處,進(jìn)行NIssl染色,并在光學(xué)顯微鏡下對(duì)灌注部位進(jìn)行評(píng)估。錯(cuò)位的套管被排除在統(tǒng)計(jì)分析之外。(五)Western Blot 檢測(cè)組織樣品在經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,在80V基層縮膠約30分鐘,120V在溶解凝膠約1小時(shí)左右處理。蛋白電泳轉(zhuǎn)移到I-P轉(zhuǎn)印膜在0.25A電流下3小時(shí)。膜用TBST(pH7.4)洗滌,并在浸漬在封閉液中4℃室溫過夜。在室溫狀態(tài)下,將凝膠膜在5%的牛血清白蛋白的TBST中,加入抗腱糖蛋白受體抗體、抗蛋白聚糖,抗神經(jīng)蛋白聚糖,和抗肌動(dòng)蛋白抗體。凝膠膜在TBST緩沖液震動(dòng)洗滌4-6分鐘后,印跡在室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗;隨后印跡繼續(xù)用TBST震動(dòng)洗滌4-6分鐘。接下來,印跡與超信號(hào)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物混合物在室溫下放置1分鐘。最后,印跡暴光,洗出X膠片光片。用Quantity One軟件量化(版本4.0.3)處理。(六)免疫熒光和圖像分析行為測(cè)試后,大鼠用戊巴比妥鈉(100 mg/kg,i.p.)麻醉后,經(jīng)心臟灌注200-250ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4),然后再用200-250ml 4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)灌注。將大鼠腦組織在溫度4℃條件下放置至少24小時(shí),隨后用30%蔗糖進(jìn)行脫水處理至少4天。使用徠卡冷凍切片機(jī)取一系列包含中內(nèi)側(cè)前額葉皮層厚度為30um的冠狀位腦切片,并儲(chǔ)存在-20℃的冷凍保護(hù)劑溶液中。切片在溫度為4℃時(shí),在生物標(biāo)記素凝集素多花紫藤溶液(WFA)的溶液中過夜。所有的切片,在溫度是25℃條件下,經(jīng)過PBS洗滌3次,加入FITC標(biāo)記的鏈霉親和素,并且需要3小時(shí)的時(shí)間完成。選取每一只大鼠各腦區(qū)的4-5個(gè)切片,使用熒光顯微鏡和圖像分析程序,來測(cè)量WFA表達(dá)陽性的神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)。根據(jù)既往研究報(bào)告,對(duì)目標(biāo)區(qū)域的任何一側(cè)的腦組織神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)的陽性表達(dá)代表了免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示各組水平,采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)的比較選擇單因素方差分析(one-way ANOVA),其中多組間比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。設(shè)定P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1、戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的癲癇的模型與人類發(fā)癲癇作類似,是理想的研究癲癇模型。2、戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的慢性癲癇模型中,發(fā)現(xiàn)了前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)(mPFC)中的PNNs(WFA+)的衰退,以及腱糖蛋白-R,聚集蛋白聚糖和神經(jīng)蛋白聚糖表達(dá)的減少。3、戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的慢性癲癇模型中AMPA受體拮抗劑NBQX可以使癲癇發(fā)作減少。4、NBQX增加mPFC中PNNs(WFA),腱糖蛋白-R,聚集蛋白聚糖和神經(jīng)蛋白聚糖表達(dá)。5、戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)慢性癲癇發(fā)作中,軟骨素酶ABC(ChABC)可引起mPFC中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的衰退。6、戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的慢性癲癇發(fā)作中,ChA1BC可以逆轉(zhuǎn)NBQX抗癲癇作用。研究結(jié)論及意義目前的數(shù)據(jù)表明,在戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的慢性癲癇模型中,AMPA受體拮抗劑NBQX通過調(diào)控內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)功能來減少癲癇發(fā)作。軟骨素酶(ChABC)可以引起內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(mPFC)中神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)的衰退,從而加劇了癲癇發(fā)作,也同時(shí)逆轉(zhuǎn)了 AMPA受體拮抗劑NBQX抗癲癇作用。這些結(jié)果表明,在內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)的抗癇作用是通過AMPA受體拮抗劑NBQX來實(shí)現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)表明前額葉皮層(mPFC)的神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)(PNNs)的功能在癲癇的病理生理之中發(fā)揮了非常重要的作用,激活神經(jīng)周圍網(wǎng)絡(luò)可能會(huì)有效地治療癲癇。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：1271806