本文關鍵詞：MIF在低氧微環(huán)境調控人CESC成軟骨及成骨分化過程中的作用機制研究

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【摘要】：背景及目的椎間盤退變是引發(fā)下腰痛最重要的原因。軟骨終板(Cartilage endplate,CEP)的退變是椎間盤退變的始動因素之一。CEP退變的重要特征是軟骨化程度降低而骨化程度增加。CEP中存在能向成軟骨方向和成骨方向分化,可以起到修復CEP作用的軟骨終板干細胞(Cartilage endplate stem cell,CESC)。CEP是一種無血管分布的低氧組織,在退變的CEP中,其生理性低氧微環(huán)境會遭到破壞。低氧對干細胞的分化具有顯著的調控作用,目前低氧對CESC分化的作用尚無研究。巨噬細胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)被認為是低氧誘導因子-1A(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF1A)的下游分子。MIF對軟骨和骨代謝有調控作用,然而MIF對干細胞成軟骨及成骨分化的作用卻沒有相關研究。本研究將著重研究HIF1A/MIF通路對CESC成軟骨及成骨分化的調控作用。方法第一部分:CEP退變/低氧的情況檢測及CESC原代分離培養(yǎng)收集椎間盤退變組和未退變組病人的CEP樣本,檢測兩組樣本中HIF1A/COL1/COL2表達量的差異;從CEP樣本中提取并篩選CESC,并對干細胞特征進行檢測。第二部分:研究HIF1A/MIF通路對CESC成軟骨及成骨分化的調控作用在常氧和低氧條件下分別對CESC進行成軟骨分化和成骨分化誘導,通過使用HIF1A的誘導劑/抑制劑,上調/下調MIF表達量來研究HIF1A/MIF通路對CESC成軟骨及成骨分化的調控作用。第三部分:MIF調控SOX9/RUNX2的作用方式研究通過熒光素酶報告基因實驗和染色質免疫共沉淀實驗來研究在低氧條件下,MIF對SOX9/RUNX2的轉錄調控作用。第四部分:高通量芯片檢測CESC在常氧/低氧下基因表達及可變剪接的變化使用HTA 2.0芯片對CESC在常氧/低氧下成軟骨/成骨分化過程中的基因表達及可變剪接的變化結果第一部分:1.在退變的CEP中HIF1A表達量降低,COL2表達量降低,COL1表達量增加2.CESC具備間充質干細胞特性第二部分1.CESC在低氧環(huán)境下成軟骨能力增強而成骨能力減弱2.低氧通過HIF1A增強CESC成軟骨分化能力抑制成骨分化能力3.低氧/HIF1A對CESC分化的影響可以被MIF表達量的人為干預所逆轉第三部分1.在CESC中,MIF在低氧條件下有入核現象2.在低氧條件下,MIF可以與SOX9啟動子區(qū)域結合,促進轉錄活性;與RUNX2啟動子區(qū)域結合,抑制轉錄活性第四部分將低氧/常氧兩組樣本間的差異表達基因(Differentially expressed gene,DEG)和可變剪接(Alternative splicing,AS)變化進行檢測后所得的數據經過基因本體(Gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析,一些GO功能和通路被富集結論1.在退變的CEP中低氧微環(huán)境被破壞,CEP軟骨化程度減少,骨化程度增加2.低氧通過HIF1A/MIF通路增強CESC成軟骨分化能力抑制成骨分化能力3.低氧條件下,MIF入核對SOX9/RUNX2進行轉錄調控4.GO分析和KEGG分析富集了一些GO功能和信號通路,為研究低氧對CESC成軟骨/成骨分化的調控提供了新的研究方向
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5

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