本文關(guān)鍵詞：砂生槐種子生物堿抗包蟲效應(yīng)及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 砂生槐種子 秀麗隱桿線蟲 包蟲 細(xì)胞免疫 PD-1

【摘要】：研究背景包蟲病是主要由棘球蚴或泡球蚴寄生于人體或動(dòng)物體內(nèi)引起的人獸共患寄生蟲病,在全球廣泛流行,嚴(yán)重危害人類健康和生命安全。目前,治療包蟲病以手術(shù)為主,但無法耐受手術(shù)或病情復(fù)雜而無法進(jìn)行手術(shù)的患者,只能依賴藥物治療,而獲批臨床使用的藥物僅有阿苯達(dá)唑和甲苯達(dá)唑兩種,品種單一,療效不理想,并且發(fā)現(xiàn)副作用多而嚴(yán)重,耐藥現(xiàn)象日益增多。因此,亟需研發(fā)療效明確、副作用小的抗包蟲藥物。從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的數(shù)千年治療蟲病的經(jīng)驗(yàn)中尋找線索,是發(fā)掘抗包蟲藥物的一個(gè)重要途徑。砂生槐為青藏高原特有植物,藏醫(yī)記載其種子性苦、寒,具有治療白喉、蟲病、中毒癥、消化不良等功效。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)砂生槐種子親脂性總生物堿在體外具有殺滅細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活性,在體內(nèi)可抑制小鼠繼發(fā)性棘球蚴生長(zhǎng),提示砂生槐種子總堿中含有驅(qū)蟲成分。但砂生槐種子在藏醫(yī)中以水煎劑入藥,親脂性總堿水溶性差、抗蟲效果弱,因此,本課題從砂生槐種子的水溶性成分中尋找有效的抗包蟲成分并研究其抗蟲機(jī)制。研究方法以乙醇為溶劑,采用熱回流提取法分離砂生槐種子生物堿,以秀麗隱桿線蟲為模型,對(duì)砂生槐種子的分離產(chǎn)物進(jìn)行殺蟲活性篩選。采用柱層析分離法,從殺蟲活性較強(qiáng)的成分中提取極性較小的餾分和極性較大的餾分,TLC定性鑒定餾分的成分,通過秀麗隱桿線蟲確定砂生槐種子的殺蟲活性成分,并通過HPLC分析其主要化學(xué)成分。分離自然感染羊肝細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié),在體外與砂生槐種子成分共同培養(yǎng)7天,觀察原頭節(jié)形態(tài)變化及存活情況,進(jìn)一步確定砂生槐種子的殺蟲活性成分。NIH小鼠腹腔注射細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)建立慢性棘球蚴病模型,BALB/c小鼠腹腔注射泡球蚴建立慢性泡球蚴病模型,分別于感染后20 w和14 w用砂生槐種子殺蟲活性成分灌胃治療,劑量為100 mg/kg/day,治療6 w后剖殺小鼠檢測(cè)。剝離棘球蚴囊泡組織,稱量濕重,常規(guī)HE染色;FCM分析脾臟CD3+、CD4+、CD8+和PD-1+的T細(xì)胞亞群;ELISA檢測(cè)IFN-γ和IL-4水平;CFSE染色檢測(cè)脾細(xì)胞增殖能力。以秀麗隱桿線蟲為模式生物,檢測(cè)砂生槐種子殺蟲活性成分作用后秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力、生殖能力、壽命、體長(zhǎng)及ROS水平,反映其抗蟲機(jī)制。體外培養(yǎng)肝細(xì)胞株Hep G-2細(xì)胞和Chang liver細(xì)胞,MTT法檢測(cè)砂生槐種子殺蟲活性成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;BALB/c小鼠口服砂生槐種子殺蟲活性成分(100 mg/kg/day)6 w后,檢測(cè)血清肝腎生化指標(biāo)和病理變化,評(píng)價(jià)砂生槐種子殺蟲活性成分的毒副作用。Ⅲ型干擾素成員IL-28B與抗原EAMMH在0、3、6 w同時(shí)注射C57BL/6小鼠,10 w分離脾細(xì)胞,FCM分析CD4+CD25+Foxp3+Treg占脾淋巴細(xì)胞比例,ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)目,間接ELISA檢測(cè)抗原特異性Ig G1和Ig G2c水平,反映IL-28B對(duì)Treg及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用,為其應(yīng)用于包蟲病治療奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果本課題從砂生槐種子獲得4種提取物:非水溶性生物堿(E1)、水溶性生物堿(E2)、水溶性非生物堿(E3)和不溶性非生物堿(E4)。E1、E2、E3和E4的殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別為31.03 mg/ml、14.29 mg/ml、29.94 mg/ml和25.64 mg/ml,E2的LC50最低。從E2中提取到極性較小的餾分E2-a和極性較大的餾分E2-b。E2-a和E2-b殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別是9.06 mg/ml和36.24 mg/ml。TLC定性鑒定,E2-a含有苦參堿和槐果堿,E2-b含有氧化苦參堿和氧化槐果堿。苦參堿和槐果堿殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別是12.03 mg/ml和9.81 mg/ml。HPLC分析100μg/ml E2-a中苦參堿和槐果堿的含量分別為42.8μg/ml和25.7μg/ml。E2-a體外作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)后,蟲體出現(xiàn)皺縮、一端或兩端出現(xiàn)氣泡、吸盤變形、頂突明顯外翻等異常表現(xiàn),活性降低。E2-b、E2、苦參堿、槐果堿在體外對(duì)原頭節(jié)活性均有不同程度影響。殺原頭節(jié)的72 h-LC50值由低到高依次是E2-a(0.35 mg/ml)、E2(0.45 mg/ml)、槐果堿(0.79 mg/ml)、苦參堿(1.16 mg/ml)、E2-b(2.12 mg/ml),E2-a的LC50值最低。治療小鼠慢性棘球蚴病的結(jié)果表明,E2-a組的棘球蚴囊泡組織濕重(8.40±2.93 g)明顯低于陰性對(duì)照組(11.33±1.64 g)(p=0.042);E2-a組的囊泡生發(fā)層與角皮層部分剝離,角皮層增厚,變得疏松,出現(xiàn)大量泡狀物,失去典型的紋狀結(jié)構(gòu),與外膜之間的界限變得模糊不清;E2-a組小鼠脾臟CD3+T細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞的比例(45.14%±23.93%)高于陰性對(duì)照組(14.74%±9.39%)(p=0.011),且主要是CD4+T細(xì)胞比例(72.28%±3.63%)高于陰性對(duì)照組(50.33%±27.92%)(p=0.036)所致,CD8+T比例無明顯升高或降低(p0.05);E2-a組小鼠PD-1+T細(xì)胞比例(9.92%±6.77%)顯著低于陰性對(duì)照組(25.51%±13.53%)(p=0.009),且CD4+PD-1+T細(xì)胞比例為5.73%±1.62%,明顯低于陰性對(duì)照組(12.59%±6.35%)(p=0.023),CD8+PD-1+T細(xì)胞比例為0.86%±0.35%,明顯低于陰性對(duì)照組(2.77%±1.87%)(p=0.020);E2-a組小鼠血清IFN-γ水平無明顯變化,血清IL-4濃度平均為4.21 pg/ml,與陰性對(duì)照組(1.13 pg/ml)比較有升高趨勢(shì);E2-a組抗原刺激后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4濃度平均為5.75 pg/ml,與陰性對(duì)照組(3.10 pg/ml)比較有升高趨勢(shì);E2-a組小鼠脾細(xì)胞增殖能力無增高。治療慢性泡球蚴病小鼠的結(jié)果表明,E2-a組小鼠的泡球蚴囊泡組織濕重為6.10±2.16 g,顯著低于陰性對(duì)照組(11.25±1.73 g)(p0.01),平均降低囊重約5.15 g;E2-a組小鼠血清INF-γ水平無降低,IL-4濃度平均為48.46pg/ml,較陰性對(duì)照組(32.08 pg/ml)明顯升高(p=0.032)。秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力檢測(cè)結(jié)果表明,8 mg/ml的E2-a作用24 h后,引起秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率降為陰性對(duì)照組的1/3(p0.01);頭部擺動(dòng)頻率平均為34.5次/min,明顯低于陰性對(duì)照組(59.1次/min)(p0.01);咽泵頻率平均為38.9次/min,低于陰性對(duì)照組(71.4次/min)(p0.01)。E2-a能夠抑制秀麗隱桿線蟲的排卵功能,8 mg/ml的E2-a處理后的秀麗隱桿線蟲每條蟲排卵總數(shù)平均為205.2,明顯低于陰性對(duì)照(248.8/蟲)(p0.01),在第3天和第4天的排卵量分別平均為36.8/蟲和13.2/蟲,明顯低于陰性對(duì)照組(分別為54.4/蟲和28.2/蟲)(p0.05),但AO染色未發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞凋亡增多。8 mg/ml E2-a組線蟲的壽命為9.1±4.1天,明顯低于陰性對(duì)照組(13.0±4.6天)(p=0.021)。8mg/ml E2-a組線蟲的體長(zhǎng)平均為447.6 pixels,明顯短于陰性對(duì)照組(486.8 pixels)(p0.01)。E2-a無誘導(dǎo)ROS水平升高的作用。體外MTT實(shí)驗(yàn)證明,濃度為1 mg/ml的E2-a作用48 h后,Hep G-2細(xì)胞和Chang liver細(xì)胞的抑制率分別為29.03%和38.36%,因此低濃度E2-a對(duì)肝細(xì)胞株Hep G-2和Chang liver細(xì)胞的增殖有一定抑制作用。小鼠口服E2-a后檢測(cè)血清肝腎生化指標(biāo),發(fā)現(xiàn)反映肝功能的指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(38.333 U/L±4.726 U/L)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(150.000 U/L±35.763 U/L)較陰性對(duì)照組(谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶分別為33.333 U/L±7.638U/L和139.667 U/L±30.172 U/L)略升高,反映腎功能的的指標(biāo)肌酐(18.000μM/L±1.000μM/L)較陰性對(duì)照組(11.000±7.211μM/L)略升高,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余指標(biāo)無明顯升高或降低,組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肝腎細(xì)胞出現(xiàn)明顯改變。包蟲感染中Treg增多,造成感染持續(xù),故下調(diào)Treg是治療包蟲病的策略之一,本課題研究了Ⅲ型干擾素成員IL-28B對(duì)Treg的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明,EAMMH-r Ad-m IL-28B組的Treg比例為0.17%±0.17%,顯著低于非特異性對(duì)照EAMMH-r Ad-EGFP(0.76%±0.25%)(p0.05);EAMMH-r Ad-m IL-28B組小鼠分泌IFN-γ的脾細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組無明顯升高;與EAMMH組比較,EAMMH/r Ad-m IL-28B組的Ig G1水平有增高趨勢(shì),而Ig G2c水平降低(p0.05)。研究結(jié)論砂生槐種子生物堿中抗蟲活性較強(qiáng)的是低極性的水溶性生物堿E2-a,其主要化學(xué)成分為苦參堿和槐果堿(68.5%)。E2-a抗包蟲的機(jī)制為損傷囊泡、誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增多、下調(diào)T細(xì)胞表面負(fù)調(diào)節(jié)分子PD-1的表達(dá)、調(diào)節(jié)IFN-γ和IL-4,促進(jìn)免疫功能。E2-a能夠影響秀麗隱桿線蟲行為能力,降低生殖能力,縮短壽命,影響發(fā)育。E2-a對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞株和小鼠的肝腎細(xì)胞有輕微毒性效應(yīng)。IL-28B可下調(diào)Treg細(xì)胞,但不增強(qiáng)Th1免疫反應(yīng),尚需進(jìn)一步研究其在包蟲治療中的作用。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭君;馬興銘;安方玉;田衛(wèi)花;;砂生槐種子水提物對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2008年04期

2 賀學(xué)強(qiáng);郭君;;砂生槐種子水提物的S_(180)小鼠體內(nèi)抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[J];華西藥學(xué)雜志;2008年04期

3 馬興銘;于紅娟;雒艷萍;崔燕;;藏藥砂生槐種子提取物抑菌和細(xì)胞毒活性的初步研究(英文)[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2008年05期

4 賀學(xué)強(qiáng);郭君;;砂生槐種子水提物對(duì)S180荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用[J];中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志;2009年S1期

5 許舒雯;陳龍勝;彭麗華;王凱;;砂生槐種子中脂肪酸成分的研究[J];現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐;2013年05期

6 張璐;李紅玉;魏玉輝;;HPLC、TLC檢測(cè)砂生槐種子中的生物堿[J];藥物分析雜志;2008年07期

7 張德華;黃仁術(shù);左露;耿朝輝;;生物堿的提取方法研究進(jìn)展[J];中國(guó)野生植物資源;2010年05期

8 賀玉琢;中國(guó)產(chǎn)麻黃屬植物的研究(3):四川省產(chǎn)麻黃屬植物中的生物堿[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊(cè));2004年04期

9 周倩;吳皓;許風(fēng)清;;半夏中生物堿的研究[J];中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志;2006年01期

10 李純毅;李贊忠;李發(fā)旺;;生物堿的提取分離方法研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古石油化工;2007年12期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馮運(yùn)靈;楊炬;吳向林;李麗;;1991-2006年寧夏包蟲病住院病例回顧性調(diào)查分析[A];第二屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

2 李麗;楊炬;吳向林;路宗人;;西吉縣學(xué)生、干部包蟲病知識(shí)及相關(guān)行為調(diào)查分析[A];第二屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

3 孫緒榮;;包蟲病影像學(xué)進(jìn)展[A];2005年全國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)學(xué)術(shù)會(huì)議西部論壇論文匯編[C];2005年

4 楊炬;李麗;劉天錫;;寧夏高危地區(qū)囊性包蟲病病例對(duì)照研究[A];第二屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

5 路宗仁;田慧芳;喬富貴;;西吉縣包蟲病調(diào)查情況分析[A];第3屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

6 楊文;;四川藏區(qū)包蟲病流行現(xiàn)狀與防治對(duì)策[A];全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

7 張文寶;張壯志;石保新;王進(jìn)成;;我國(guó)包蟲病控制策略及控制學(xué)急需解決的問題[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

8 姜萬庫;;試述包蟲病的藥物治療研究[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)第八次全國(guó)寄生蟲學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2001年

9 徐之杰;張崇友;鐔云輝;王春榮;;黑龍江省包蟲病流行概況[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)全國(guó)第九次寄生蟲學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2003年

10 耿藝介;高世同;黃達(dá)娜;李曉恒;劉建平;張仁利;;深圳市兩例輸入性囊型包蟲病病例分析研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆全國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)術(shù)會(huì)議暨第四屆中國(guó)現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)培訓(xùn)項(xiàng)目匯編[C];2009年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 常曉蘭;200萬元助推包蟲病防治[N];甘孜日?qǐng)?bào)(漢文);2006年

2 常曉蘭;衛(wèi)生部包蟲病防治工作專項(xiàng)調(diào)研組來我州調(diào)研[N];甘孜日?qǐng)?bào)(漢文);2007年

3 陳飛;包蟲病防治之困[N];健康報(bào);2007年

4 楊尚海;色達(dá)縣雙管齊下防治“包蟲病”[N];甘孜日?qǐng)?bào)(漢文);2008年

5 特約記者 文瓊;爐霍開展包蟲病防治宣傳活動(dòng)[N];甘孜日?qǐng)?bào)(漢文);2008年

6 鄉(xiāng)城縣委宣傳部;鄉(xiāng)城縣采取措施防控包蟲病[N];甘孜日?qǐng)?bào)(漢文);2009年

7 康定縣疾控中心;康定縣全力推進(jìn)包蟲病防治工作[N];甘孜日?qǐng)?bào)(漢文);2009年

8 特約記者 梁艷;包蟲病防治項(xiàng)目縣增加到29個(gè)[N];阿克蘇日?qǐng)?bào);2009年

9 記者李春霞;我區(qū)農(nóng)牧區(qū)包蟲病患者可獲免費(fèi)治療[N];新疆日?qǐng)?bào)(漢);2009年

10 記者 郎花;國(guó)家加大對(duì)我區(qū)包蟲病防治工作支持力度[N];新疆科技報(bào)(漢);2009年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 雒艷萍;砂生槐種子生物堿抗包蟲效應(yīng)及機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2017年

2 劉菲;生物堿類物質(zhì)檢測(cè)方法及毒性分析研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

3 李肖紅;肝泡型包蟲病邊界的~(18)F-FDG生物學(xué)特征與臨床研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年

4 何翼彪;數(shù)字化三維重建技術(shù)在肝泡型包蟲病外科治療中的應(yīng)用及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年

5 袁苗苗;抗包蟲藥物的篩選及植入式醫(yī)療器械電源系統(tǒng)的研究[D];蘭州大學(xué);2016年

6 李志文;茄子體內(nèi)糖苷生物堿的含量分布特征及其化學(xué)生態(tài)學(xué)功能研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 趙玉敏;青藏高原東段（甘南藏族自治州）包蟲病的流行病學(xué)研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 張琰;包蟲病所致免疫應(yīng)答及易感性的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2006年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭偉華;蜂產(chǎn)品中生物堿的分布與變化規(guī)律研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 彭英麗;磷鉀營(yíng)養(yǎng)對(duì)黃檗幼苗生長(zhǎng)主要生物堿含量的影響[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

3 張育;基于手性離子液體的毛細(xì)管電泳技術(shù)在金雞納生物堿分離中的應(yīng)用研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王玉靈;唐古特莨菪提取物與分離所得生物堿的殺蟲殺螨活性研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 張瑋琴;馬鈴薯中糖苷生物堿的提取及其抑菌活性的研究[D];石河子大學(xué);2015年

6 張意涵;附子煎煮、炮制化學(xué)成分變化規(guī)律研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 朱海萍;流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析延胡索生物堿的應(yīng)用研究[D];陜西理工學(xué)院;2016年

8 陳亞麗;禿瘡花生物堿有效部位的分離純化和8-乙酰氨基異紫堇堿的藥動(dòng)學(xué)研究[D];蘭州大學(xué);2016年

9 蒲俊松;桑葉生物堿的檢測(cè)提取及含量分析[D];西南大學(xué);2016年

10 梁盟;氣象因子對(duì)烤煙生物堿及其主要組分含量的影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

，

本文編號(hào)：1271012