本文關(guān)鍵詞：PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在糖尿病小鼠足細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機制研究

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【摘要】：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一,其主要臨床特點為:尿蛋白排泄率逐漸增加,腎功能減退直至終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)的發(fā)生。既往研究認為,DN的主要病理學特征為腎小球系膜細胞增殖,細胞外基質(zhì)堆積,系膜增厚及腎間質(zhì)纖維化,但這些因素只能解釋30%-50%的尿蛋白排泄率和腎小球濾過率的變化。近年來,腎小球濾過屏障(Glomerular filtration barrier,GFB)結(jié)構(gòu)和功能的改變,尤其是作為GFB重要組成部分的足細胞在DN發(fā)生和發(fā)展過程中的作用逐漸成為研究的熱點。研究表明,足細胞是腎小球中分化程度最高的細胞,其自身修復(fù)能力有限,其損傷與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量研究表明,高糖環(huán)境下?lián)p傷的線粒體過度釋放活性氧(Reactive oxygen species,ROS)所致的氧化應(yīng)激,是糖尿病腎病足細胞損傷的共同基礎(chǔ),氧化應(yīng)激可以通過多種方式導(dǎo)致足細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激可以通過影響足細胞功能蛋白如Nephrin、Podocalyxin和Desmin的表達,導(dǎo)致足細胞功能障礙和從基底膜脫落。Nephrin為足細胞裂孔隔膜的主要成分,在糖尿病腎病患者中其表達明顯下降,且下降程度與蛋白尿的進展呈正相關(guān)。Podocalyxin是足細胞表面帶負電荷的跨膜蛋白,是組成腎小球電荷屏障的基礎(chǔ)。Desmin是一種中間絲蛋白,在正常足細胞中極少表達,但在損傷的足細胞中大量表達,是足細胞損傷的標志蛋白。氧化應(yīng)激還可以通過線粒體凋亡通路介導(dǎo)足細胞凋亡,在糖尿病高血糖狀態(tài)下,氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體損傷,線粒體外膜通透性增加,膜電位去極化,導(dǎo)致線粒體膜轉(zhuǎn)運孔開放,細胞色素C(Cyto-C)釋放到胞質(zhì)中,導(dǎo)致Caspase的瀑布效應(yīng),最后激活caspase-3,誘導(dǎo)足細胞凋亡。因此,足細胞內(nèi)損傷的線粒體需要被及時有效的清除,而細胞清除損傷或衰老線粒體的主要途徑即線粒體自噬(Mitophagy)。線粒體自噬指細胞通過自噬的方式“選擇性地”清除損傷線粒體的過程,從而維持細胞內(nèi)線粒體質(zhì)量和數(shù)量的平衡,在改善細胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。線粒體自噬的選擇性啟動與PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)密切相關(guān)。PINK1是一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,位于Parkin(E3泛素連接酶)的上游發(fā)揮作用。損傷的線粒體其膜電位發(fā)生去極化改變,從而引起PINK1蛋白在損傷線粒體外膜上的積聚,進而吸引Parkin聚集到損傷的線粒體上。Parkin可導(dǎo)致線粒體外膜蛋白泛素化,募集其它自噬相關(guān)蛋白如LC3等向線粒體轉(zhuǎn)位,介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。綜上所述,受損線粒體過度釋放ROS所致的氧化應(yīng)激,是糖尿病足細胞損傷的中心環(huán)節(jié)。線粒體自噬是一種有選擇性的自噬,是特異清除損傷線粒體的過程。因此推測,線粒體自噬在改善糖尿病狀態(tài)下足細胞氧化應(yīng)激損傷具有重要意義。然而目前,有關(guān)糖尿病狀態(tài)下足細胞內(nèi)線粒體自噬功能狀態(tài),以及線粒體自噬與足細胞氧化應(yīng)激關(guān)系的研究尚未見報道。因此,本課題開展以下研究:第一部分高糖培養(yǎng)的足細胞和糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中線粒體自噬功能狀態(tài)的研究目的觀察高糖培養(yǎng)的足細胞和糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中線粒體自噬的功能狀態(tài),初步探討PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬與足細胞氧化應(yīng)激損傷關(guān)系。方法1.以正常糖濃度(5.6 mmol/L)培養(yǎng)分化后足細胞為正常對照組(NG),高糖組(HG)用糖濃度25 mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于24小時,48小時和72小時,用Mito SOX結(jié)合流式細胞儀檢測線粒體ROS(mt ROS);透射電鏡檢測線粒體超微結(jié)構(gòu),損傷線粒體百分比及被自噬體包裹的線粒體百分比;羅丹明123結(jié)合流式細胞儀檢測線粒體膜電位(MTP);熒光定量PCR分別檢測PINK1,LC3和Parkin m RNA表達;Westernblot分別檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足細胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin蛋白表達;Annexin V-FITCPI結(jié)合流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。6周齡SPF級健康雄性KM小鼠36只,體重為(26±2)g,在IVC系統(tǒng)中喂養(yǎng)1W以適應(yīng)環(huán)境,自由供給食物和水,25度恒溫恒濕,每12小時開關(guān)燈模擬晝夜環(huán)境。實驗隨機選取9只為NG組,29只構(gòu)建DM小鼠小鼠模型。具體方法為:于實驗前一天晚上停止喂食,12小時后按60 mg/kg在小鼠腹腔一次性注射1%STZ溶液,72h后斷尾采血監(jiān)測血糖并重復(fù)3次,以血糖≥16.7 mmol/L為1型糖尿病成模標準,NG組給予腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。所有小鼠于造模成功后的4W、8W和12W末,麻醉收集標本后處死。用透射電鏡檢測線粒體超微結(jié)構(gòu),損傷線粒體百分比和被自噬體包裹的線粒體百分比;丙二醛(MDA)試劑盒檢測MDA;熒光定量PCR分別檢測PINK1,LC3和Parkin m RNA表達;Westernblot分別檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足細胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin的蛋白表達;PAS染色檢測腎小球糖原堆積;TUNEL染色檢測凋亡;透射電鏡檢測足細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果1.與NG組相比,高糖刺激后線粒體形態(tài)發(fā)生顯著改變。NG組線粒體形態(tài)正常,呈桿狀或橢圓形,線粒體外膜(OMM)光滑完整,脊形態(tài)完整,線粒體內(nèi)膜(IMM)內(nèi)電子密度均勻。高糖刺激后,隨著時間的延長線粒體形態(tài)出現(xiàn)異常且逐漸加重,從輕度腫脹,外膜增厚到空泡樣變,脊斷裂或消失,外膜破裂。(圖1.1 C)與NG組相比,高糖刺激24 h、48 h和72 h后,足細胞線粒體膜電位(MTP)顯著下降(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.1 D,E)與NG組相比,高糖刺激24 h、48 h和72 h后,足細胞內(nèi)損傷線粒體百分比明顯增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.1 F)與NG組相比,高糖刺激24 h時被自噬體包裹的線粒體百分比略有下降,但下降程度無統(tǒng)計學意義(P0.05),48h和72h時被自噬體包裹的線粒體百分比下降(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.1 G)與NG組相比,高糖刺激24 h、48 h和72 h后,足細胞線粒體ROS(mt ROS)顯著增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.1 A,B)。2.與NG組相比,高糖刺激24 h后,PINK1 m RNA表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);高糖刺激48h和72h后,PINK1 m RNA表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.2 A)與NG組相比,高糖刺激24h、48h、72h后,LC3和Parkin m RNA表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(圖1.2 B,C)與NG組相比,高糖刺激24h后,PINK1蛋白表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);高糖刺激48h和72h后,PINK1蛋白表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.2 D,F)與NG組相比,高糖刺激24h后,LC3Ⅱ蛋白表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);高糖刺激48h和72h后,LC3Ⅱ蛋白表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.2 D,G)與NG組相比,高糖刺激24h后,Mito-Parkin蛋白表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);高糖刺激48h和72h后,Mito-Parkin蛋白表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.2 E,H)與NG組相比,高糖刺激24h后,Cyto-Parkin蛋白表達略有升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);高糖刺激48h和72h后,Cyto-Parkin蛋白表達升高(P0.05),且升高程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.2 E,I)3.與NG組相比,高糖刺激24h、48h、72h后,Nephrin和Podocalyxin蛋白表達顯著下降(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.3 A,B,C)。與NG組相比,高糖刺激24h、48h、72h后,Desmin蛋白表達顯著增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.3 A,D)。與NG組相比,高糖刺激24h、48h、72h后,足細胞凋亡比例顯著增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.3 E,F)。4.與NG組相比,糖尿病組小鼠足細胞內(nèi)線粒體形態(tài)學發(fā)生顯著改變。NG組線粒體形態(tài)正常,呈桿狀或橢圓形,線粒體外膜(OMM)光滑完整,脊形態(tài)完整,線粒體內(nèi)膜(IMM)內(nèi)電子密度均勻。糖尿病組小鼠,隨著時間的延長線粒體出現(xiàn)形態(tài)異常且逐漸加重,從輕度腫脹,外膜增厚到空泡樣變,脊斷裂或消失,外膜破裂。(圖1.4 A)與NG組相比,DM 4w,8w和12w組小鼠足細胞內(nèi)損傷線粒體百分比明顯增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.4 B)與NG組相比,DM 4w組小鼠足細胞內(nèi)被自噬體包裹的線粒體百分比略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),DM 8w和12w組小鼠足細胞內(nèi)被自噬體包裹的線粒體百分比下降(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.4 C)與NG組相比,DM 4w,8w和12w組小鼠腎皮質(zhì)MDA含量顯著增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.4 D)5.與NG組相比,DM 4w組小鼠PINK1 m RNA表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);8w和12w組小鼠PINK1 m RNA表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.5 A)與NG組相比,DM 4w、8w和12w組小鼠LC3和Parkin m RNA表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義。(圖1.5 B,C)與NG組相比,DM 4w組小鼠PINK1蛋白表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);8w和12w組小鼠PINK1蛋白表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.5 D,F)與NG組相比,DM 4w組小鼠LC3Ⅱ蛋白表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);8w和12w組小鼠LC3Ⅱ蛋白表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.5 D,G)與NG組相比,DM 4w組小鼠Mito-Parkin蛋白表達略有下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);8w和12w組小鼠Mito-Parkin蛋白表達降低(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.5 E,H)與NG組相比,DM 4w組小鼠Cyto-Parkin蛋白表達略有升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);8w和12w組小鼠Cyto-Parkin蛋白表達升高(P0.05),且升高程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.5 E,I)6.與NG組相比,DM 4w、8w和12w組小鼠Nephrin和Podocalyxin蛋白表達顯著下降(P0.05),且下降程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.6 A,B,C)與NG組相比,DM 4w、8w和12w組小鼠Desmin蛋白表達顯著升高(P0.05),且升高程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.6 A,D)與NG組相比,腎小球PAS染色發(fā)現(xiàn)DM 4w、8w和12w組小鼠腎小球體積明顯增大,腎小球內(nèi)細胞外基質(zhì)逐漸增多,基底膜逐漸增厚;TUNEL染色發(fā)現(xiàn)DM 4w、8w和12w組小鼠足細胞凋亡比例顯著增加(P0.05),且增加程度呈時間依賴性(P0.05)。(圖1.6 E)與NG組相比,DM 4w、8w和12w組透射電鏡顯示,隨著病程的延長足細胞密度越來越低,足突增寬逐漸加重,甚至融合消失。(圖1.6 F)結(jié)論1.無論是在高糖培養(yǎng)的足細胞還是在糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中,損傷的線粒體增多,mt ROS釋放增加,導(dǎo)致足細胞氧化應(yīng)激損傷加重。2.高糖培養(yǎng)的足細胞和糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中,PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬水平下降,對損傷線粒體清除能力不足。第二部分PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在高糖培養(yǎng)的足細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機制目的在細胞學水平,探討PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在高糖培養(yǎng)的足細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機制。方法構(gòu)建PINK1過表達慢病毒表達載體(LV-PINK1)和PINK1短發(fā)夾RNA(sh RNA)慢病毒表達載體(LV-sh-PINK1)及空慢病毒載體(LV-NC)。轉(zhuǎn)染正常糖濃度(5.6 mmol/L)培養(yǎng)小鼠足細胞,按不同培養(yǎng)環(huán)境和處理分為:正糖對照組(NG),高糖組(HG,25 mmol/L),高糖PINK1上調(diào)組(HG+LV-PINK1),高糖PINK1下調(diào)組(HG+LV-PINK1),以及高糖空載體對照組(HG+LV-NC)。各組處理72h后,Mito SOX結(jié)合流式細胞儀檢測線粒體ROS(mt ROS);透射電鏡檢測線粒體超微結(jié)構(gòu),損傷線粒體百分比和被自噬體包裹的線粒體百分比;羅丹明123結(jié)合流式細胞儀檢測線粒體膜電位(MTP);熒光定量PCR分別檢測PINK1,LC3和Parkin m RNA表達;Westernblot分別檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足細胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin的蛋白表達;免疫熒光檢測PINK1,LC3表達和細胞內(nèi)定位;Annexin V-FITCPI結(jié)合流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。結(jié)果1.與NG組相比,HG組線粒體膜電位(MTP)顯著下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組MTP進一步下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組MTP顯著升高(P0.05),但仍略低于NG組(P0.05)。(圖2.1)2.與NG組相比,HG組線粒體活性氧(mt ROS)生成顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組mt ROS進一步增高(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組mt ROS顯著下降(P0.05),但仍略高于NG組(P0.05)。(圖2.2)3.電鏡下NG組線粒體形態(tài)正常,呈桿狀或橢圓形,線粒體外膜(OMM)光滑完整,脊形態(tài)完整,線粒體內(nèi)膜(IMM)內(nèi)電子密度均勻。HG組和HG+LV-sh-PINK1組足細胞內(nèi)線粒體腫脹變圓,外膜增厚空泡樣變,脊斷裂或消失,外膜不完整。HG+LV-PINK1組被自噬體包裹的線粒體即“線粒體自噬體”明顯增多,其余線粒體形態(tài)正常,未見腫脹,脊斷裂等,外膜完整光滑。(圖2.3 A)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)損傷線粒體百分比明顯增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組損傷線粒體百分比進一步增高(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組損傷線粒體百分比顯著下降(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.3 B)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)被自噬體包裹的線粒體比例明顯減少(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組被自噬體包裹的線粒體比例進一步減少(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組被自噬體包裹的線粒體比例顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.3 C)4.與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)PINK1 m RNA表達下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組PINK1 m RNA表達顯著下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組PINK1 m RNA表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.4 A)各組之間足細胞內(nèi)Parkin m RNA表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(圖2.4 B)各組之間足細胞內(nèi)LC3 m RNA表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(圖2.4 C)5.與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)PINK1蛋白表達下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組PINK1蛋白表達顯著下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組PINK1蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.5 A,B)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)LC3Ⅱ蛋白表達下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組LC3Ⅱ蛋白表達顯著下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組LC3Ⅱ蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.5 A,C)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)線粒體上Parkin(Mito-Parkin)蛋白表達下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組Mito-Parkin蛋白表達顯著下降(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組Mito-Parkin蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.5 D,E)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)細胞質(zhì)中Parkin(Cyto-Parkin)蛋白表達升高(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組Cyto-Parkin蛋白表達顯著升高(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組Cyto-Parkin蛋白表達顯著降低(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖2.5 D,F)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)PINK1表達減少(P0.05),且定位于線粒體的PINK1也減少(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組PINK1表達顯著降低(P0.05),且定位于線粒體的PINK1顯著減少(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組線粒體表達顯著升高(P0.05),定位于線粒體的PINK1也顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.5 G)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)LC3表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但定位于線粒體的LC3有所降低(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組LC3表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但定位于線粒體的LC3顯著減少(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組LC3表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但定位于線粒體的LC3顯著增多(P0.05),且多于NG組(P0.05)。(圖2.5 H)6.與NG組相比,HG組足細胞細胞質(zhì)內(nèi)Cyto-C顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組細胞質(zhì)內(nèi)Cyto-C顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組細胞質(zhì)內(nèi)Cyto-C顯著減少(P0.05),且少于NG組(P0.05)。(圖2.6 A)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)Caspase 3活性顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組Caspase 3活性顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組Caspase 3活性顯著減少(P0.05),且少于NG組(P0.05)。(圖2.6 B)與NG組相比,HG組足細胞凋亡率顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組足細胞凋亡率顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組足細胞凋亡率顯著降低(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖2.6 C,D)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著降低(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著降低(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖2.6 E,F,H)與NG組相比,HG組足細胞內(nèi)Desmin蛋白表達顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-sh-PINK1組Desmin蛋白表達顯著增加(P0.05)。與HG組相比,HG+LV-PINK1組Desmin蛋白表達顯著降低(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖2.6 E,G)結(jié)論1.高糖狀態(tài)下,足細胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷與PINK1介導(dǎo)線粒體自噬水平下降呈負相關(guān)。2.上調(diào)高糖狀態(tài)下PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬,可顯著改善足細胞氧化應(yīng)激損傷,其機制為通過對損傷線粒體的清除,減少mt ROS的生成,從而減輕足細胞功能蛋白表達障礙和線粒體凋亡通路的激活。第三部分PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在糖尿病小鼠足細胞氧化應(yīng)激損傷中的保護作用目的體內(nèi)驗證PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在糖尿病小鼠足細胞氧化應(yīng)激損傷中的保護作用方法6W齡雄性健康SPF級KM小鼠40只,在IVC系統(tǒng)中喂養(yǎng)1W以適應(yīng)環(huán)境,自由供給食物和水,25度恒溫恒濕,每12小時開關(guān)燈模擬晝夜環(huán)境。STZ一次性腹腔注射構(gòu)建1型DM小鼠模型。造模成功后,將小鼠隨機分為3組:糖尿病組(DM組),糖尿病PINK1過表達慢病毒組(DM+LV-PINK1),以及糖尿病慢病毒空載體組(DM+LV-NC),并以同期正常小鼠為正常對照組(NG)。小鼠麻醉后,在解剖顯微鏡下右側(cè)腎皮質(zhì)上,中,下三極,點注射PINK1過表達慢病毒和空慢病毒載體10ul。病毒注射12W后,麻醉收集標本后處死小鼠,用透射電鏡檢測線粒體超微結(jié)構(gòu),損傷線粒體百分比和被自噬體包裹的線粒體百分比;丙二醛(MDA)試劑盒檢測MDA;熒光定量PCR分別檢測PINK1,LC3和Parkin m RNA表達;Westernblot分別檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足細胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin的蛋白表達;PAS染色檢測腎小球糖原堆積;TUNEL染色檢測凋亡;透射電鏡檢測足細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果1.電鏡下NG組小鼠足細胞內(nèi)線粒體形態(tài)正常,呈桿狀或橢圓形,線粒體外膜(OMM)光滑完整,脊形態(tài)完整,線粒體內(nèi)膜(IMM)內(nèi)電子密度均勻。DM組小鼠足細胞內(nèi)線粒體腫脹變圓,外膜增厚空泡樣變,脊斷裂或消失,外膜不完整。DM+LV-PINK1組小鼠足細胞內(nèi)被自噬體包裹的線粒體即“線粒體自噬體”明顯增多,其余線粒體形態(tài)正常,未見腫脹,脊斷裂等,外膜完整光滑。(圖3.1 A)與NG組相比,DM組小鼠足細胞內(nèi)損傷線粒體百分比明顯增加(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組損傷線粒體百分比顯著下降(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.1 B)與NG組相比,DM組足細胞內(nèi)線粒體自噬體比例明顯減少(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組線粒體自噬體顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.1 C)與NG組相比,DM組小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)MDA明顯增加(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組腎皮質(zhì)內(nèi)MDA顯著下降(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖3.1 D)2.與NG組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)PINK1 m RNA表達下降(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組PINK1 m RNA表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.2 A)各組之間腎皮質(zhì)內(nèi)Parkin m RNA表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(圖3.2 B)各組之間LC3 m RNA表達無顯著區(qū)別,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(圖3.2 C)3.與NG組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)PINK1蛋白表達下降(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組PINK1蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.3 A,B)與NG組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)LC3Ⅱ蛋白表達下降(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組LC3Ⅱ蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.3 A,C)與DM組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)線粒體上Parkin(Mito-Parkin)蛋白表達下降(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組Mito-Parkin蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.3 D,E)與NG組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)細胞質(zhì)中Parkin(Cyto-Parkin)蛋白表達升高(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組Cyto-Parkin蛋白表達顯著降低(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖3.3 D,F)與NG組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)PINK1表達減少(P0.05),且定位于線粒體的PINK1也減少(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組線粒體表達顯著升高(P0.05),定位于線粒體的PINK1也顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.3 G)與NG組相比,DM組腎皮質(zhì)內(nèi)LC3表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但定位于線粒體的LC3有所降低(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組LC3表達無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但定位于線粒體的LC3顯著增多(P0.05),且多于NG組(P0.05)。(圖3.3 H)4.Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)與NG組相比,DM組足細胞內(nèi)Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著降低(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.4 A,B,D)與NG組相比,DM組足細胞內(nèi)Desmin蛋白表達顯著增加(P0.05)。與HG組相比,DM+LV-PINK1組Desmin蛋白表達顯著降低(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖3.4 A,C)腎小球PAS染色發(fā)現(xiàn),與NG組相比,DM組小鼠腎小球體積明顯增大,腎小球內(nèi)細胞外基質(zhì)增多,基底膜增厚;與DM相比,DM+LV-PINK1組上述情況有顯著改善。(圖3.4 E)TUNEL染色發(fā)現(xiàn),與NG組相比,DM組小鼠足細胞凋亡比例顯著增加(P0.05);與DM相比,DM+LV-PINK1組小鼠足細胞凋亡比例顯著下降(P0.05),但仍略高于NG組(P0.05)。(圖3.4 E)腎小球免疫組化顯示,與NG組相比,DM組足細胞內(nèi)Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著降低(P0.05)。與DM組相比,DM+LV-PINK1組Nephrin、Podocalyxin蛋白表達顯著升高(P0.05),且高于NG組(P0.05)。(圖3.4 F)與NG組相比,DM組足細胞內(nèi)Desmin蛋白表達顯著增加(P0.05)。與HG組相比,DM+LV-PINK1組Desmin蛋白表達顯著降低(P0.05),且低于NG組(P0.05)。(圖3.4 F)透射電鏡顯示,與NG組相比,DM組小鼠腎小球足細胞密度降低,足突增寬,融合消失。與DM相比,DM+LV-PINK1組上述情況有顯著改善。(圖3.4 G)5.與NG組小鼠相比,DM組小鼠體重(BW)顯著下降(P0.05)。與DM組小鼠相比,DM+LV-PINK1組體重顯著增加(P0.05),但仍低于NG組(P0.05)。(表3.1)與NG組小鼠相比,DM組和DM+LV-PINK1組小鼠血糖(BG)顯著升高(P0.05),DM組和DM+LV-PINK1組兩組間血糖無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(表3.1)與NG組小鼠相比,DM組小鼠組BG、UPro/24h、UAIb、Scr、BUN顯著升高(P0.05)。與DM組小鼠相比,DM+LV-PINK1組BG、UPro/24h、UAIb、Scr、BUN顯著下降(P0.05),但仍略高于NG組(P0.05)。(表3.1)結(jié)論1.上調(diào)糖尿病小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬水平,可顯著改善足細胞氧化應(yīng)激損傷。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1270034