本文關(guān)鍵詞：TRIM31在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究

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【摘要】：固有免疫是機體抵抗外界病毒、細菌等微生物感染的第一道防線,病毒的核酸成分可以引起機體的免疫應答反應。固有免疫的激活需要模式識別受體(pattern recognition receptors.PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。細胞內(nèi)存在的多種模式識別受體可以識別病毒的核酸成分,如Toll 樣受體(Toll-like receptors.TLRs)中的 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9,可以識別暴露于細胞內(nèi)體中中的病毒RN A和DN A。細胞漿中游離的RN A成分可被維甲酸誘導基因Ⅰ受體(RIG-I-like receptors,RLRs)中的RIG-I或MDA5所識別。游離于細胞漿中的病毒DNA成分則可以被cGAS、IFI16、DDX41等DNA受體識別。天然免疫細胞的PRRs識別病毒的核酸成分后,引起一系列信號通路的活化,誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,最終清除感染機體的病原微生物。線粒體抗病毒蛋白MAVS(也被稱作IPS1,VISA或Cardif)是RLRs信號通路中重要的接頭分子。研究表明,RNA病毒感染機體后可引起MAVS構(gòu)象發(fā)生變化,形成朊蛋白樣(prion-like)聚集體。MAVS朊蛋白白樣聚集體的形成對RLRs信號通路的活化起著關(guān)鍵作用,然而MAVS形成聚集體的分了機制并不清楚。MAVS在線粒體上的定位對其功能發(fā)揮起著決定性的作用,因此我們假設(shè)定位于線粒體上的蛋白可能會對MAVS的功能有一定的調(diào)控作用。TRIM31屬于E3泛素連接酶家族中的一員,在癌癥等人類疾病中發(fā)揮著重要作用,也有文章報道TRIM31可以部分定位在線粒體上,因此本論文探索了TRIM31是否通過影響MAVS功能進而調(diào)控天然免疫抗病毒反應。我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM31可以正向調(diào)控MAVS所介導的Ⅰ型干擾素的生成,TRIM31特異性敲基因小鼠更加易于感染RNA病毒。具體機制依賴于TRIM31可以對MAVS第10位、第311位及第461位的賴氨酸進行K63位泛素化修飾,從而促進MAVS朊蛋白樣聚集體的形成,最終促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。一.研究目的:探討TRIM31是否影響MAVS所介導的信號通路,并闡明其具體分子機制,最后通過敲基因小鼠動物模型驗證TRIM31影響抗病毒天然免疫的生理意義。二.研究方法:1.TRIM31在細胞內(nèi)的定位將含GFP標簽的TRIM31過表達載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中,培養(yǎng)24小時后,SeV感染6小時。免疫熒光技術(shù)檢測TRIM31在線粒體上的定位情況。取健康C57 BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同時間點后,提取線粒體蛋白,Western Blotting方法檢測TRIM31在細胞漿及線粒體上的蛋白含量。2.TRIM31調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒反應2.1 TRIM31過表達對IFN-β產(chǎn)生的影響在HEK293T細胞系中轉(zhuǎn)染Flag標簽的TRIM31過表達載體,培養(yǎng)24小時后,SeV感染或轉(zhuǎn)染poly(I:C)系列時間點,實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β產(chǎn)生的變化。2.2 TRIM31干擾后對IFN-β產(chǎn)生的影響提取小鼠腹腔原代巨噬細胞,轉(zhuǎn)染小干擾RNA減低TRIM31的表達,SeV感染不同時間點,實時熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測IFN-β產(chǎn)生及分泌。2.3TRIM31對病毒復制的影響分別轉(zhuǎn)染TRIM31干擾RNA或者TRIM31過表達載體于HEK293T細胞中,用VSV感染不同時間點,實時熒光定量 PCR方法檢測IFN-β產(chǎn)生和VSV mRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復制情況;收集細胞上清,利用病毒空斑實驗檢測病毒滴度情況。3.TRIM31敲除對機體抗病毒的生理意義3.1 TRIM31敲除后對IFN-β產(chǎn)生的影響提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,分別用5'ppp-RNA、LPS、Poly(I:C)等刺激,或者 SeV、HSV-1 感染,實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β及IFN相關(guān)基因的表達。3.2TRIM31敲除對機體中病毒復制的影響取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,用VSV或HSV-1感染不同時間點,實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β表達和病毒mRNA水平的變化;收集細胞上清,病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度;Western Blotting方法檢測VSV蛋白的表達變化。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠,腹腔注射VSV或HSV-1,24小時后小鼠眼球取血的到血清,ELISA檢測血清中IFN-β分泌變化;取肝臟、脾臟、肺臟及腦組織,提取總RNA,實時熒光定量PCR方法檢測組織中IFN-β和病毒mRNA水平的變化;提取蛋白白,Western Blotting方法檢測VSV蛋白水平的變化;組織研磨得到上清,病毒空斑實驗方法檢測病毒滴度變化;免疫組化及HE染色方法觀察組織損傷情況。4.TRIM31對RLR信號通路活化的影響將TRIM31過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系24小時后,SeV或HSV-1感染不同時間點,Western Blotting檢測TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的含量變化情況;非變性Western Blotting檢測IRF3二聚化情況;通過雙熒光素酶報告基因手段檢測IRF3報告基因活性的變化情況。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,SeV或HSV-1感染不同時間點,Western Blotting檢測TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的變化情況;非變性Western Blotting檢測IRF3二聚化情況。5.TRIM31靶分子的尋找將RLR信號通路中相關(guān)的接頭分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等過表達載體與TRIM31表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,利用實時熒光定量 PCR及雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測TRIM31對不同接頭蛋白所介導的IFN-β卩 mRNA表達及報告基因活性的影響。將相關(guān)接頭分子過表達載體與TRIM31表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與各接頭分子的結(jié)合情況。6.TRIM31與MAVS結(jié)合實驗提取C56BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同時間點,用TRIM31特異性抗體進行免疫共沉淀實驗,檢測內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合。利用體外翻譯系統(tǒng)分別得到TRIM31與MAVS的蛋白,免疫共沉淀實驗檢測體外表達的TRIM31與MAVS的結(jié)合情況。分別構(gòu)建TRIM31的截斷突變體與MAVS的截斷突變體,共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與MAVS的截斷突變體的結(jié)合情況,尋找TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。7.TRIM31對MAVS的泛素化情況將Flag標簽的TRIM31過表達載體、Myc標簽的目的分子過表達載體和HA標簽的泛素過表達載體(WT、K48或K63)共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,24小時后提取蛋白,用Myc特異性抗體進行免疫共沉淀,Western Blotting檢測TRIM31對目的分子泛素化水平的影響及泛素化形式的影響。構(gòu)建一系列Myc標簽的MAVS賴氨酸點突變過表達載體,分別與Flag標簽的TRIM31過表達載體和HA標簽的泛素過表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,24小時后提取蛋白,免疫共沉淀技術(shù)檢測TRIM31對不同賴氨酸點突變載體泛素化的影響,探討MAVS上被TRIM31催化形成泛素鏈的賴氨酸位點。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同時間點后,提取細胞蛋白,利用MAVS特異性抗體進行免疫共沉淀,Western Blotting方法檢測TRIM31對MAVS內(nèi)源性泛素化水平的影響。將MAVS構(gòu)建到含有T7啟動子的PCDNA3.1-Myc過表達載體,將TRIM31構(gòu)建到含有T7啟動子的PCDNA3.1-Flag過表達載體上,使用Promega公司的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)(TNT Quick Coupled Transcription/Translation System)對表達載體進行體外轉(zhuǎn)錄翻譯,將翻譯的蛋白,加入BostonBiochem公司生產(chǎn)的體外泛素修飾系統(tǒng)(包含El,UbcH5a,K48.K63,K48R或者K63R等蛋白),室溫反應,使用Myc標簽抗體進行免疫共沉淀,檢測TR1M31對MAVS進行invitro泛素化的情況及泛素化形式。8.TRIM31通過E3連接酶活性影響RLR信號通路構(gòu)建TRIM31泛素連接酶功能缺失點突變載體,利用實時熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報告基因技術(shù),Western Blotting技術(shù)檢測TRIM31泛素連接酶功能缺失后對RLR信號通路介導的IFN-β產(chǎn)生的影響,對病毒復制的影響,對MAVS泛素化的影響,以及對MAVS多聚化形成的影響。9.基因恢復實驗進一步證實證明TRIM31通過泛素化MAVS影響RLR介導的信號通路提取TRIM31缺陷MEF細胞,分別轉(zhuǎn)染空對照載體、野生型TRIM31過表達載體及E3泛素連接酶功能缺失點突變過表達載體,用實時熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報告基因技術(shù),Western Blotting技術(shù)檢測特異性恢復TRIM31基因表達后對IFN-β產(chǎn)生的影響,對病毒復制的影響,對MAVS泛素化的影響,以及對MAVS多聚化形成的影響。10.TRIM31對MAVS形成朊蛋白樣多聚體的影響轉(zhuǎn)染TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系,或者用TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞、小鼠胚胎成纖維細胞,SeV感染不同時間點后,提取細胞線粒體,直接利用SDD-AGE方法檢測TRIM31過表達或者缺失后對MAVS朊蛋白樣多聚體形成的影響;或者將提取的SeV預刺激的線粒體進行體外泛素化修飾,反應結(jié)束后,再SDD-AGE方法檢測TRIM31對MAVS體外朊蛋白樣多聚體形成的影響。三.實驗結(jié)果1.RNA病毒感染介導TRIM31募集到線粒體上有文獻報道,TRIM31分布于線粒體上及細胞漿中,為了進一步研究RNA病毒感染是否影響TRIM31在線粒體的定位,我們將含有GFP標簽的TRIM31過表達載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中,培養(yǎng)24小T后,再感染SeV6小時,利用線粒體標記蛋白作為參照,免疫熒光技術(shù)觀察TRIM31在線粒體上的定位情況。我們發(fā)現(xiàn)SeV病毒感染介導了TRIM31向線粒體上募集。提取C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同T間點后,提取線粒體蛋白,用Western Blotting方法檢測TRIM31在線粒體上的含量,我們發(fā)現(xiàn)細胞SeV病毒感染后,定位于線粒體上TRIM31蛋白含量明顯增加。以上結(jié)果提示我們RNA病毒感染會引起TRIM31向線粒體的募集。2.TRIM31正向調(diào)控RLR介導的IFN-β的產(chǎn)生進而增強天然免疫抗病毒反應2.1 TRIM31過表達促進RNA病毒介導的IFN-β的產(chǎn)生為了探究TRIM31是否影響RLR信號通路,在HEK293T細胞或Hela細胞中轉(zhuǎn)染Flag標簽的TRIM31過表達載體,培養(yǎng)24小時后,SeV分別感染4小時、8小時、12小時或轉(zhuǎn)染poly(I:C)6小時、12小時,實時熒光定量PCR的方法檢測IFN-β mRNA水平的變化,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達后,SeV感染及poly(I:C)轉(zhuǎn)染引起的IFN-β mRNA水平明顯升高。這預示著TRIM31正向調(diào)控RLR所介導的IFN-β的產(chǎn)生。2.2 TRIM31干擾抑制RNA病毒介導的IFN-β的產(chǎn)生。為了進一步明確TRIM31在RLR信號通路所起的作用,我們合成了 TRIM31小鼠源和人源的小干擾RNA,提取小鼠腹腔原代巨噬細胞,用轉(zhuǎn)染小干擾的方法將降低TRIM31的表達,SeV分別感染4小時、8小時、12小時,實時熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)檢測IFN-β3產(chǎn)生及分泌。結(jié)果顯示,TRIM31干擾后,SeV感染所介導的IFN-β的在m RNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯下降,這進一步證明了 TRIM31可以正向調(diào)控RLR所介導的IFN-β的產(chǎn)生。2.3 TRIM31的抗病毒作用為了研究TRIM31對機體的抗病毒作用,轉(zhuǎn)染TRIM31特異性小干擾RNA或者TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系,掊養(yǎng)24小時候,用含有綠色熒光蛋白的VSV-GFP進行感染,實時熒光定量PCR技術(shù)檢測IFN-β的產(chǎn)生和VSV mRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復制情況;收集細胞上清,進行病毒空斑實驗檢測病毒滴度。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31十擾后,VSV感染引起IFN-βmRNA水平表達明顯下降,進而使得VSV病毒逃逸并大量復制。病毒空斑實驗同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾組中VSV病毒滴度明顯升高。相反的,過表達TRIM31之后,VSV介導的IFN-βmRNA水平的產(chǎn)生明顯升高,VSV病毒mRNA水平明顯下降,熒光顯微鏡觀察病毒的復制能力減弱,病毒空斑實驗證明TRIM31過表達組的VSV病毒滴度明顯下降。由此我們可以看到TRIM31在機體抗病毒中起著十分重要的作用。3.TRIM31抗病毒的生理意義3.1 TRIM31缺陷抑制RNA病毒引起的IFN-β產(chǎn)生為了進一步驗證TRIM31在RLR信號通路中所起的作用及TRIM31抗病毒的生理意義,我們構(gòu)建了 TRIM31特異性敲基因小鼠,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,分別使用LPS、Poly(I:C)等TLR通路配體刺激細胞,SeV、VSV等RLR通路配體感染細胞,HSV-1等DNA配體感染細胞,實時熒光定量PCR方法檢測IFN-β及IFN相關(guān)基因ISGs的表達差異,我們發(fā)現(xiàn)SeV感染或5'ppp-RNA轉(zhuǎn)染后,TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細胞所表達的IFN-β以及IFN-β相關(guān)基因如Cc15、Cxc1 10的表達明顯下降。而使用LPS、Poly(I:C)刺激或HSV-1感染的野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞所表達的IFN-β以及IFN-β相關(guān)基因無明顯變化差異。我們分別提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的胚胎成纖維細胞或者骨髓來源巨噬細胞,重復上面的實驗,得到相似的結(jié)論。這說明TRIM31特異性敲除可以明顯抑制RNA病毒介導的I型干擾素的生成,而對TLR信號通路等沒有影響。3.2 TRIM31敲基因小鼠更易于感染RNA病毒由于Ⅰ型干擾素與病毒的復制、清除有著直接關(guān)系,我們進一步研究了 TRIM31在機體抵抗病毒復制方面的生理意義,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,然后用VSV或HSV-1進行感染,實時熒光定量PCR技術(shù)檢測IFN-β和VSV在mRNA水平的變化;收集細胞上清,利用病毒空斑實驗檢測病毒滴度差異。收取細胞蛋白,Western Blotting方法檢測VSV蛋白水平的表達差異。我們發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比較,TRIM31敲基因小鼠被VSV感染后產(chǎn)生IFN-β在mRNA水平明顯下降,而VSV在mRNA水平則明顯升高;病毒空斑實驗顯示TRIM31敲基因小鼠VSV病毒滴度明顯升高。我們通過腹腔注射VSV病毒的方法建立小鼠的RNA病毒感染模型,觀察小鼠的死亡率,繪制小鼠生存曲線,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠在病毒感染后的死亡率史高;小鼠眼球取血得到血清,ELISA方法檢測TRIM31敲基因小鼠感染后血清中IFN-β的產(chǎn)量明顯低于野生型小鼠;處死小鼠后取肝臟、脾臟和肺臟,提取組織總RNA和蛋白,實時熒光定量PCR方法檢測到TRIM31敲基因小鼠感染后的肝臟、脾臟和肺臟中IFN-β3的表達明顯低于野生型小鼠,而VSV的mRNA則明顯高于野生型小鼠;Western Blotting方法檢測同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后各組織中VsV蛋白含量也是明顯高于野生型小鼠;肝臟、脾臟和肺臟等組織研磨得到上清,病毒空斑實驗檢測病毒滴度,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后的病毒滴度明顯高于野生型小鼠;取小鼠肺臟組織進行免疫組織化學及HE染色,觀察肺損傷情況,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠病毒感染后肺損傷比野生型小鼠更加嚴重。以上結(jié)果說明相比于野生型小鼠,TRIM31敲基因小鼠更容易感染RNA病毒。我們通過腹腔注射HSV-1病毒的方法建立小鼠的DNA病毒感染模型重復以上實驗,則發(fā)現(xiàn),野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠在抵抗DNA病毒的過程中沒有明顯的差異。4.TRIM31對RLR信號通路活化的影響RLR信號通路活化后可以引起TBK1的自身磷酸化及激酶活性的激活,進而引起IRF3的磷酸化,磷酸化后的IRF3發(fā)生二聚化并入核,結(jié)合到IFN的啟動子區(qū)域,引起IFN-β的產(chǎn)生。因此,TBK1的磷酸化及IRF3的磷酸化、二聚化、入核代表RLR信號通路的活化。我們轉(zhuǎn)染TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系,分別用SeV感染4小時、8小時、12小時,Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達后病毒介導的TBK-1和IRF3磷酸化明顯增強,IRF3進入細胞核中的含量也明顯增加,利用非變性Western Blotting發(fā)現(xiàn)過表達TRIM31可以促進病毒介導的IRF3二聚體的形成。利用雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測IRF3活性的變化,將IRF3的報告基因與TRIM31過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T,SeV感染后,我們發(fā)現(xiàn)過表達TRIM31明顯促進病毒介導的IRF3的報告基因的活性。利用DNA病毒HSV-1感染細胞,利用以上手段發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達并未影響DNA病毒介導的TBK1、IRF3的磷酸化。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細胞,分別用SeV感染細胞,Western Blotting檢測手段發(fā)觀TRIM31敲除后SeV介導的TBK-1和IRF3磷酸化明顯減弱,IRF3進入細胞核中的含量也明顯減少,利用非變性Western Blotting發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除可以抑制IRF3 一聚體的形成。利用DNA病毒HSV-1感染細胞,重復上述實驗,發(fā)現(xiàn)HSV-1介導的TBK1及IRF3的活化并未受到影響。以上結(jié)果從多個層次說明TRIM31特異性促進RLR信號通路的活化,而對DNA病毒介導的信號通路活化沒有影響。5.TRIM31靶分子的尋找前面結(jié)果表明TRIM31促進RNA病毒引起的IFN-β的產(chǎn)生,對病毒的復制起著明顯的抑制作用。那么TRIM31是如何影響RLR所介導的信號通路的,具體的作用靶點是什么。接下來,我們將RLR信號通路中相關(guān)的接頭分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、1RF3-5D等接頭蛋白的過表達載體與TRIM31表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,利用實時熒光定量PCR及雙熒光素酶報告基因技術(shù)檢測TRIM31對不同接頭蛋白所介導的IFN-β m RNA產(chǎn)生及報告基因活性的影響,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達明顯可以促進RIG-I、MDA5、MAVS接頭蛋白所介導的IFN-β3 mRNA的產(chǎn)生以及IFN-β報告基因活性,而對接頭TBK1、IKKε、IRF3-5D介導的IFN-β的產(chǎn)生沒有影響。結(jié)合之前我們發(fā)現(xiàn)TRIM31在RNA病毒感染后可以募集到線粒體上的現(xiàn)象,提示我們TRIM31作用靶點有可能是MAVS。為了進一步驗證這一假設(shè),我們將RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過表達載體與TRIM31過表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與各接頭分子的結(jié)合情況,結(jié)果顯示TRIM31與MAVS有明顯結(jié)合作用,而與其他接頭分子沒有結(jié)合作用。因此我們得出結(jié)論TRIM31 可能通過靶向MAVS進而調(diào)控RLR所介導的信號通路。6.TRIM31的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MAVS的proline-rich結(jié)構(gòu)域相結(jié)合為了更加細致深入的研究TRIM31與MAVS的結(jié)合情況,我們進一步檢測了它們內(nèi)源性的結(jié)合情況,提取小鼠腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同時間點,用內(nèi)源性TRIM31抗體進行免疫共沉淀實驗,檢測內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合,我們觀察到隨著病毒感染時間的增加,TRIM31與MAVS結(jié)合也逐漸增強,兩者的結(jié)合存在時間依賴性。為了進一步驗證兩者是否是直接性結(jié)合,我們利用體外翻譯系統(tǒng),過表達TRIM31與MAVS的蛋白,免疫共沉淀實驗檢測發(fā)現(xiàn)外源性表達TRIM31 與 MAVS發(fā)生了直接結(jié)合。為了探究TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域,我們構(gòu)建了一系列TRIM31 與 MAVS的截斷突變體,將各截斷體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,免疫共沉淀實驗檢測TRIM31與MAVS的截斷突變體的結(jié)合情況,實驗表明TRIM31的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MAVS的proline-rich結(jié)構(gòu)域在TRIM31與MAVS的結(jié)合過程中起著重要的作用。7.TRIM31對MAVS的泛素化實驗TRIM31屬于TRIM家族,是E3泛素連接酶的一種,因此我們想進一步明確TRIM31對MAVS是否進行了泛素化修飾。我們將Flag標簽的TRIM31過表達載體,Myc標簽MAVS過表達載體和HA標簽的泛素表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,培養(yǎng)24小時后提取蛋白,用Myc特異性抗體進行免疫共沉淀,Western Blotting結(jié)果顯示TRIM31 可以促進MAVS的K63位泛素化修飾。MAVS分子上共有14個賴氨酸位點,為了詳細闡明TRIM31對其中哪個氨基酸位點進行了泛素化修飾,我們構(gòu)建了 一系列MAVS賴氨酸點突變過表達載體,與TRIM31過表達載體及泛素過表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞系,免疫共沉淀技術(shù)及Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)TRIM31主要將MAVS上的第10位,第311位,第461位賴氨酸進行K63位泛素化修飾。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同時間點,提取細胞蛋白,利用MAVS內(nèi)源性抗體進行免疫共沉淀,Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導的MAVS內(nèi)源性K63位泛素化水平明顯下降,而TRIM31對MAVS的K48位泛素化修飾無明顯影響。我們進一步通過體外蛋白翻譯系統(tǒng)和體外泛素化系統(tǒng),檢測TRIM31對MVAS的體外泛素化修飾情況,結(jié)果表明TRIM31可以在體外系統(tǒng)直接促進MAVS的K63位泛素化修飾。以上結(jié)果表明,E3泛素連接酶TRIM31可以將MAVS的第10位,第311位,第461位賴氨酸進行K63位泛素化修飾。8.TRIM31通過其E3泛素連接酶功能對RLR信號通路的影響為了進一步驗證TRIM31是否通過其E3泛素連接酶功能影響RLR信號通路,我們構(gòu)建了 TRIM31泛素連接酶功能缺失點突變過表達載體,通過實時熒光定量PCR技術(shù)、雙熒光素酶報告基因技術(shù)、Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)缺失了 E3泛素連接酶功能后,TRIM31對RLR信號通路介導的IFN-β的產(chǎn)生失去了促進作用,TRIM31的抗病毒作用也隨即消失。以上結(jié)論說明TRIM31通過其E3泛素連接酶活性促進RLR介導的I型干擾素的產(chǎn)生及抗病毒作用。9.TRIM31促進MAVS的多聚化TRIM31對MAVS進行K63位泛素化修飾的機制我們已做了大量研究,然而TRIM31對MAVS修飾后如何調(diào)控MAVS的功能是我們進一步要探討的重要問題。已有文章報道MAVS在RNA病毒感染后形成朊蛋白樣多聚體,該多聚體的形成對于MAVS進一步活化下·游信號通路起到至關(guān)重要的作用,然而MAVS如何形成朊蛋白白樣多聚體還不得而知。因此我們進行實驗驗證TRIM31對MAVS的K63泛素化修飾是否促進MAVS多聚體的形成。我們分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過表達載體于HEK293T細胞系,SeV感染不同時間點后,提取細胞線粒體,利用SDD-AGE技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達明顯促進SeV介導的MAVS多聚體的形成。我們進一步提取SeV預刺激后巨噬細胞的線粒體,與體外翻譯得到的TRIM31蛋白共同加入體外泛素化系統(tǒng),反應結(jié)束后,SDD-AGE檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31體外明顯促進SeV介導的MAVS多聚體的形成。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細胞,SeV感染不同時間點,提取線粒體蛋白,SDD-AGE技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后明顯抑制SeV介導的MAVS多聚體的形成。以上實驗表明TRIM31可以促進MAVS朊蛋白樣多聚化的形成,進而影響MAVS的活化及IFN-β的產(chǎn)生。10.基因恢復實驗證明TRIM31特異性調(diào)控MAVS活化及RLR介導的信號通路我們提取TRIM31敲基因小鼠MEF細胞,分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過表達載體,SeV或VSV感染細胞,分別使用實時熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報告基因技術(shù),ELISA技術(shù),Western Blotting技術(shù)進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31基因敲除后SeV誘導的MAVS形成朊蛋白樣多聚體的能力減弱,IFN-β產(chǎn)生減少,病毒復制明顯增加;重新過表達TRIM31后,由TRIM31缺陷導致的對RLR信號通路及病毒復制的影響隨即消失。以上結(jié)果進一步證明了 TRIM31對于RLR介導信號通路的影響。我們同樣利用基因恢復實驗進一步驗了MAVS的K63位泛素化對RLR信號轉(zhuǎn)導過程的影響,在MAVS特異性敲除MEF細胞中,重新轉(zhuǎn)染野生型MAVS過表達載體、K10、K311、K461位賴氨酸位點突變MAVS過表達載體與野生型TRIM31過表達載體、E3連接酶功能缺失點突變過表達載體載體,SeV或VSV感染一系列時間點,利用實時熒光定量量PCR,雙熒光素酶報告基因技術(shù),Western Blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),MAVS敲除后,SeV介導的RLR信號通路被阻斷,重新轉(zhuǎn)染野生型MAVS 后,RLR介導·的I型十擾素產(chǎn)生得到恢復;TRIM31過表達促進RLR介導的Ⅰ型十擾素的生成;然而轉(zhuǎn)染K10、K311、K461位賴氨酸位點突變MAVS表達載體后,RLR介導的信號通路的阻斷不能得到恢復。以上結(jié)果說明TRIM31對于MAVS的K10、K311、K461位賴氨酸位點的K63位泛素化直接影響MAVS活化及RLR信號通路的轉(zhuǎn)導。四.結(jié)論及創(chuàng)新性1.首次證明了 TRIM31在RLR信號通路中發(fā)揮作用TRIM31屬于TRIM家族中的一員,已有研究表明TRIM31在消化系統(tǒng)相關(guān)癌癥中發(fā)揮著重要作用。然而TRIM31是否參與到天然免疫信號轉(zhuǎn)導目前還沒有報道。我們首先發(fā)現(xiàn)了 TRIM31在RNA病毒介導的天然免疫信號轉(zhuǎn)導及機體抗病毒反應中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。2.首次發(fā)現(xiàn)了對MAVS進行K63位泛素化修飾的分子對于MAVS的泛素化修飾大多集中在K48位泛素化修飾,至今仍未發(fā)現(xiàn)對MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾的分子,我們的發(fā)現(xiàn)填補了這一空白。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31促進IFN-β的產(chǎn)生,這一現(xiàn)象是通過其E3泛素連接酶對MAVS進行K63位泛素化修飾引起的;同時我們明確了對TRIM31對MAVS泛素化修飾的位點,分別是MAVS第10位,第311位,第461位賴氨酸。3.為探索影響MAVS多聚化形成的因素提供了新思路MAVS作為RLR信號通路重要的接頭蛋白,RNA病毒感染機體后,MAVS構(gòu)象發(fā)生改變,形成朊蛋白樣多聚體,該多聚體的形成是MAVS活化下游信號通路的前提條件,然而對于MAVS多聚化形成的調(diào)節(jié)機制并不明確。我們研究發(fā)現(xiàn),SeV感染后,TRIM31募集到線粒體上,并與MAVS結(jié)合并促進MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾,這種K63位的修飾調(diào)控MAVS朊蛋白樣多聚體的形成,進而促進IFN-β的產(chǎn)生,發(fā)揮抗病毒作用。4.為臨床抗病毒研究提供了潛在的治療靶點病毒感染仍舊是全世界面臨的重要問題,病毒的高變異性更給我們治療病毒性疾病帶來巨大的難度。我們研究發(fā)現(xiàn)TRIM31可以靶向MAVS促進IFN-β的產(chǎn)生,發(fā)揮抗病毒作用。這一發(fā)現(xiàn),可以為臨床治療病毒感染性疾病提供新思路與治療靶點。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392
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本文編號：1269909