本文關(guān)鍵詞：長春西汀對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的SD大鼠心肌肥大的作用機(jī)制研究

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【摘要】：心肌肥大多是高血壓性心臟病在病理學(xué)上表現(xiàn),是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,但其發(fā)展演變的具體機(jī)制尚不完全明確。心肌肥大是為了提供正常心搏出量的一種代償性反應(yīng),預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥大可以顯著改善患者的預(yù)后,因此,進(jìn)一步研究心肌肥大發(fā)生的機(jī)制是非常必要的。MAPK和PI3K-AKt介導(dǎo)的信號(hào)通路是心肌肥大形成過程中的重要信號(hào)通路。研究他們的表達(dá)將有助于揭示心肌肥大及其逆轉(zhuǎn)作用的機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度在心肌肥大和心力衰竭中起關(guān)鍵作用。在心肌肥大和心力衰竭模型中Na+流入的增加或Na+內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度增加。鈉通道蛋白5型α亞基(SCN5A)、Na+/K+-ATP酶(NKA)三種亞型和Na+/H+交換蛋白1(NHE1),都是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)鈉通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。長春西汀具有電壓依賴性鈉通道抑制作用。長春西汀抑制大鼠的心肌細(xì)胞鈉電流,其抑制心肌細(xì)胞鈉電流的作用為劑量依賴性和電壓依賴性且可逆,對(duì)鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活和失活過程的影響,可使緩慢失活的鈉電流減少。其對(duì)心肌細(xì)胞鈉通道的抑制作用與河豚毒素(TTX)具有明顯相似性。有研究表明,河豚毒素能夠抑制心肌肥大。長春西汀是否也具有抑制心肌肥大的作用,有待進(jìn)一步研究。長春西汀關(guān)于長春西汀對(duì)心血管系統(tǒng)的影響和治療作用研究較少,還沒有涉及心肌肥大的研究。體外和體內(nèi)研究表明,應(yīng)用異丙腎上腺素(ISO)是常用的建立心肌肥大模型的方法。我們將以異丙腎上腺素誘導(dǎo)形成心肌細(xì)胞和整體動(dòng)物心肌肥大模型為研究對(duì)象,運(yùn)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)等技術(shù),研究長春西汀是否能通過抑制MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大的發(fā)生發(fā)展,以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的鈉通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的影響,觀察其對(duì)整體動(dòng)物心肌肥大模型的作用。第一部分長春西汀對(duì)體外培養(yǎng)ISO誘導(dǎo)SD大鼠肥大心肌細(xì)胞的影響目的:觀察長春西汀對(duì)體外培養(yǎng)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的影響,探討磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和MAPKs信號(hào)通路的調(diào)控作用;檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度和關(guān)鍵鈉通道及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),探討其在心肌肥大調(diào)控中作用。方法:體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞,mtt法測(cè)定長春西汀對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響,確定安全藥物濃度,心肌細(xì)胞經(jīng)過72小時(shí)培養(yǎng),dmem培養(yǎng)基(不含血清、酚紅)處理,分成6個(gè)組:(1)對(duì)照組(controlgroup):加等量的dmem;(2)iso組:異丙腎上腺素(10μmol/l);(3)vinp1組:iso+vinp(5μmol/l);(4)vinp2組:iso+vinp(10μmol/l);(5)vinp3組:iso+vinp(20μmol/l);(6)vinp4組:iso+vinp(40μmol/l)。應(yīng)用藥物處理48小時(shí)后,測(cè)定細(xì)胞表面積,心肌細(xì)胞蛋白含量等細(xì)胞表型變化,應(yīng)用藥物處理6小時(shí)后,反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)檢測(cè)心肌細(xì)胞的anp、bnp、pi3k、aktmrna水平,應(yīng)用蛋白印跡法檢測(cè)總的akt和磷酸化akt、總的erk和磷酸化erk、總的jnk和磷酸化jnk、總的p38和磷酸化p38表達(dá)相對(duì)含量;檢測(cè)鈉通道蛋白5型α亞基(scn5a)、na+/k+-atp酶(nka)三種亞型(nka-α1、nka-α2、nka-α3)、na+/h+交換蛋白1(nhe1)的表達(dá)。使用共聚焦成像檢測(cè)載有鈉敏感性熒光染料corona綠的心肌細(xì)胞中鈉離子濃度。結(jié)果:(1)長春西汀濃度依賴性的降低肥大心肌細(xì)胞的心肌細(xì)胞表面積和總蛋白含量,抑制肥大心肌細(xì)胞anp、bnpmrna的表達(dá),改善pi3k、aktmrna表達(dá),增加磷酸化akt蛋白表達(dá),減少磷酸化erk、p38蛋白表達(dá)。(2)長春西汀抑制了iso誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的增加;iso組和長春西汀組的心肌細(xì)胞中scn5a的蛋白表達(dá)沒有顯著變化(p0.05),但是在心肌細(xì)胞中,iso使nka-α2和nka-α3的蛋白表達(dá)顯著降低(兩者均為p0.05),但是nka-α1不受影響(p0.05,iso相對(duì)于對(duì)照組)。長春西汀明顯減弱了iso對(duì)nka-α2和nka-α3蛋白表達(dá)的抑制(p0.05,長春西汀組相對(duì)于iso組)。與nka-α2和nka-α3的蛋白表達(dá)的減少相反,iso使得nhe-1蛋白表達(dá)顯著增加,而且增加不受長春西汀的影響。結(jié)論:長春西汀對(duì)iso誘導(dǎo)的心肌肥大具有抑制作用。其可能機(jī)制為:通過影響pi3k-akt和mapk信號(hào)通路和鈉通道的阻斷作用。第二部分長春西汀對(duì)iso誘導(dǎo)心肌肥大sd大鼠心肌重構(gòu)的影響目的:研究長春西汀對(duì)iso誘導(dǎo)心肌肥大sd大鼠心肌重構(gòu)的影響。方法:將55只成年雄性sd大鼠隨機(jī)分成4組:對(duì)照組10只、通過iso誘導(dǎo)建立的大鼠心肌肥大模型組45只。將心肌肥大模型組大鼠隨機(jī)分為3組:單純心肌肥大模型組(iso組)15只,治療組又分為:單純心肌肥大+長春西汀10mg(vinpi組)15只,單純心肌肥大+長春西汀20mg(vinpii組)15只。所有大鼠相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),成年雄性SD大鼠清醒狀態(tài)下每日分兩次(上午10點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各1次)經(jīng)背部皮下注射5 mg/kg/d異丙腎上腺素,共連續(xù)給藥4周。對(duì)照組大鼠相同方式給予2ml生理鹽水也分兩次(上午10點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各1次)經(jīng)背部皮下注射。對(duì)照組大鼠和心肌肥大組同時(shí)給予每日2ml生理鹽水灌胃治療;Vinp I組和Vinp II組每日分兩次(上午10點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各1次)經(jīng)背部皮下注射5mg/kg/d異丙腎上腺素同時(shí),分別給予長春西汀10 mg/kg/d和20 mg/kg/d灌胃治療;處理4周后觀察的主要指標(biāo)有:各組動(dòng)物尾動(dòng)脈血壓(代替平均動(dòng)脈壓作為衡量心臟后負(fù)荷的指標(biāo))、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌肥大細(xì)胞最短直徑和橫截面積、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量等各項(xiàng)心肌肥大指標(biāo)。結(jié)果:(1)長春西汀緩解ISO導(dǎo)致的大鼠尾動(dòng)脈血壓下降。長春西汀抑制了ISO誘導(dǎo)的單純心肌肥大組左心室重量、左心室質(zhì)量指數(shù)的升高(P0.05),差異具有顯著性。(2)長春西汀治療組與心肌肥大組大鼠相比,心肌細(xì)胞最短徑和心肌細(xì)胞橫斷面面積下降(P0.05),有顯著性差異。(3)長春西汀治療組與心肌肥大組大鼠相比,心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)和心肌羥脯氨酸含量均明顯下降(P0.05),有顯著性差異。結(jié)論:長春西汀具有改善ISO誘導(dǎo)的心肌肥大SD大鼠心肌重構(gòu)的作用。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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