發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 08:29

  本文關(guān)鍵詞：聚乙二醇化氨磷汀的制備及其體內(nèi)外安全性和抗氧化特性的初步研究

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【摘要】：氨磷汀是一種廣譜的正常組織細(xì)胞抗氧化保護(hù)劑,在患者接受化療或放射性治療時(shí),它能夠選擇性保護(hù)正常組織器官不受氧化損傷,同時(shí)不影響腫瘤治療的效果�；熀头派湫灾委熢跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)造成全身系統(tǒng)性的損傷,其損傷的主要原因之一就是由細(xì)胞毒性藥物或射線所產(chǎn)生的大量ROS對(duì)各臟器造成的氧化應(yīng)激傷害。氨磷汀的分子末端具有一個(gè)可水解的硫代磷酸根,該基團(tuán)在堿性磷酸酶的最適p H條件下快速水解,釋放出游離的巰基。游離的巰基能夠與氧化自由基(ROS)發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而減輕或消除后者對(duì)組織器官的氧化損傷。正常組織細(xì)胞表面堿性磷酸酶含量較高,且細(xì)胞間液偏堿性,因此氨磷汀在正常細(xì)胞內(nèi)能夠快速水解為活性代謝產(chǎn)物,繼而保護(hù)正常組織免受氧化損傷。而在腫瘤組織部位,大部分的腫瘤細(xì)胞膜表面堿性磷酸酶含量較低,且腫瘤細(xì)胞因缺氧等代謝異常行為導(dǎo)致其間液p H呈偏酸性,不利于堿性磷酸酶發(fā)揮作用,因此,氨磷汀無法快速有效的在腫瘤部位水解而影響腫瘤治療的效果。因氨磷汀與ROS的反應(yīng)是不可逆的消耗性的,而產(chǎn)生的大量ROS需要極高血藥濃度的氨磷汀進(jìn)行中和;同時(shí),由于氨磷汀的活性代謝產(chǎn)物極不穩(wěn)定,且易被腎臟快速清除,因此,為得到理想的治療效果,臨床上的氨磷汀使用劑量常常達(dá)到人的最大耐受劑量,從而導(dǎo)致使用氨磷汀的患者常會(huì)遭受劑量依賴的毒副作用,如一過性低血壓,惡心和嘔吐等,也使得氨磷汀的使用存在極大的局限性。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一種FDA批準(zhǔn)的可降解生物材料,它可以與不同種類藥物結(jié)合,改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和安全性指標(biāo)。聚乙二醇修飾廣泛應(yīng)用于多種治療試劑,如蛋白或多肽藥物、小分子藥物以及納米化的藥物輸運(yùn)系統(tǒng)。聚乙二醇修飾能夠改善不同藥物試劑的溶解性、免疫原性、酶解特性以及體內(nèi)的生物分布、網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬作用和腎臟清除率等。因此,小分子藥物與聚乙二醇分子連接后,其體內(nèi)循環(huán)半衰期和生物利用度均可得到提升。目前,有關(guān)氨磷汀的聚乙二醇化修飾還沒有任何報(bào)道。于是,我們選擇帶有功能性末端的聚乙二醇對(duì)氨磷汀不參加反應(yīng)的氨基末端進(jìn)行修飾。由于直鏈聚乙二醇分子只能于其一端或兩端載帶一個(gè)或兩個(gè)氨磷汀分子,且聚乙二醇與氨磷汀之間的分子量存在較大差異,因此,為提高氨磷汀的載帶率,我們選擇了四臂的聚乙二醇進(jìn)行研究。在此工作中,我們通過琥珀酰亞胺活性酯與氨基的高效反應(yīng),構(gòu)建了共價(jià)連接的四臂聚乙二醇化氨磷汀,并對(duì)其結(jié)構(gòu)、形貌以及水解活力進(jìn)行了表征。并且進(jìn)一步檢測(cè)了聚乙二醇化氨磷汀的細(xì)胞攝取能力、細(xì)胞毒性、抗氧化能力以及其體內(nèi)、外的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:四臂聚乙二醇連接氨磷汀的效率約為75%,即平均一分子的聚乙二醇末端共價(jià)連接了三分子的氨磷汀。氨磷汀與聚乙二醇連接后,由于分子纏繞及靜電作用等因素,聚乙二醇化氨磷汀相互纏繞,形成團(tuán)簇狀球形納米顆粒。這一形貌的變化預(yù)示著聚乙二醇化修飾改變了游離氨磷汀所具備的一系列理化特性。首先,氨磷汀能夠在堿性磷酸酶催化作用下快速水解,生成含有自由巰基的活性代謝產(chǎn)物,而聚乙二醇修飾后的團(tuán)簇狀納米顆粒結(jié)構(gòu)改變了其在堿性磷酸酶催化下的反應(yīng)速率,使氨磷汀的快速水解特性變?yōu)榭煽氐木徛尫胚^程。提示了其可能在體內(nèi)具有長(zhǎng)效穩(wěn)定的抗氧化保護(hù)作用。在細(xì)胞攝取行為中,我們發(fā)現(xiàn)聚乙二醇化的氨磷汀與游離的氨磷汀小分子自由擴(kuò)散進(jìn)入胞內(nèi)的方式不同,它可能是通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并定位于酸性溶酶體中的。在胞吞過程中,聚乙二醇化氨磷汀與細(xì)胞膜接觸的時(shí)間延長(zhǎng),使其能夠充分的與膜表面堿性磷酸酶接觸,最大程度的釋放有效的抗氧化巰基末端。在安全性評(píng)價(jià)研究中,游離氨磷汀具有較嚴(yán)重的細(xì)胞毒性,且這一細(xì)胞毒性可通過抑制堿性磷酸酶活性而得到緩解,說明其損傷因素主要為氨磷汀脫磷酸水解后所產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物。而在同樣的條件下,聚乙二醇化氨磷汀卻對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎沒有影響。氨磷汀活性代謝產(chǎn)物中的自由巰基在氧化損傷的過程中,是起到抗氧化保護(hù)作用的主要成分。而對(duì)于ROS水平較低的組織細(xì)胞,大量的小分子自由巰基易于發(fā)生自由擴(kuò)散,并與細(xì)胞組織中生物大分子結(jié)合,破壞其生物結(jié)構(gòu),因而產(chǎn)生較嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。而聚乙二醇化修飾給固定化的氨磷汀巰基末端提供了空間位阻并限制了它的自由運(yùn)動(dòng),減少并阻礙了其末端自由巰基與生物大分子的接觸,從而降低了氨磷汀的細(xì)胞毒性。在評(píng)價(jià)抗氧化能力的研究中,我們通過雙氧水刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS進(jìn)而構(gòu)建了氧化損傷模型。聚乙二醇化氨磷汀在與細(xì)胞共孵育的24h內(nèi),均可保護(hù)其不受ROS的傷害,展示出穩(wěn)定高效的抗氧化能力。相反,氨磷汀對(duì)細(xì)胞的保護(hù)時(shí)間更短,且長(zhǎng)時(shí)間孵育還會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的ROS。二者對(duì)化療藥物損傷的細(xì)胞的保護(hù)作用具有類似的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn),聚乙二醇化氨磷汀同樣能夠選擇性保護(hù)細(xì)胞膜表面高表達(dá)堿性磷酸酶的細(xì)胞,使其免受化療藥物順鉑的損傷,而對(duì)細(xì)胞膜表面低表達(dá)堿性磷酸酶的細(xì)胞幾乎無保護(hù)作用。聚乙二醇化氨磷汀展現(xiàn)了極優(yōu)的體外安全性及藥效學(xué)特性,于是我們進(jìn)一步驗(yàn)證了其體內(nèi)的生物學(xué)活性。聚乙二醇化修飾增加了氨磷汀的分子量,因此,在體內(nèi)應(yīng)用之前,我們首先確定了它的體內(nèi)安全劑量,這一安全劑量中所包含的有效氨磷汀的量?jī)H約為游離氨磷汀體內(nèi)使用劑量的十分之一。我們利用熒光素模擬氨磷汀,檢測(cè)了聚乙二醇化氨磷汀的體內(nèi)分布,發(fā)現(xiàn)其在腎臟中含量最多且滯留時(shí)間較長(zhǎng)。在給予化療藥物順鉑的小鼠體內(nèi),注射聚乙二醇化氨磷汀能夠完全逆轉(zhuǎn)由順鉑引起的腎臟脂質(zhì)過氧化損傷。而游離的氨磷汀非但沒有產(chǎn)生保護(hù)活性,還加重了腎臟的損傷程度。隨后,我們?cè)u(píng)價(jià)了氨磷汀與聚乙二醇化氨磷汀在小鼠受到放射性損傷后,對(duì)動(dòng)物骨髓中淋巴細(xì)胞的保護(hù)效果。無論是游離的還是經(jīng)過修飾的氨磷汀,其對(duì)骨髓淋巴細(xì)胞都有一定程度的保護(hù)作用,但是并未完全消除掉輻射所引起的細(xì)胞損傷。綜上,我們的工作第一次以聚乙二醇為骨架對(duì)氨磷汀進(jìn)行修飾,并發(fā)現(xiàn)聚乙二醇化氨磷汀相比游離的氨磷汀具有更優(yōu)的體內(nèi)、外安全性及生物活性,這些優(yōu)勢(shì)使得聚乙二醇化氨磷汀在臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用過程中具有極大的發(fā)展前景。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R943

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