發(fā)布時間：2017-12-09 08:29

  本文關鍵詞：聚乙二醇化氨磷汀的制備及其體內外安全性和抗氧化特性的初步研究

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【摘要】：氨磷汀是一種廣譜的正常組織細胞抗氧化保護劑,在患者接受化療或放射性治療時,它能夠選擇性保護正常組織器官不受氧化損傷,同時不影響腫瘤治療的效果�；熀头派湫灾委熢跉[瘤細胞的同時會造成全身系統性的損傷,其損傷的主要原因之一就是由細胞毒性藥物或射線所產生的大量ROS對各臟器造成的氧化應激傷害。氨磷汀的分子末端具有一個可水解的硫代磷酸根,該基團在堿性磷酸酶的最適p H條件下快速水解,釋放出游離的巰基。游離的巰基能夠與氧化自由基(ROS)發(fā)生氧化還原反應,從而減輕或消除后者對組織器官的氧化損傷。正常組織細胞表面堿性磷酸酶含量較高,且細胞間液偏堿性,因此氨磷汀在正常細胞內能夠快速水解為活性代謝產物,繼而保護正常組織免受氧化損傷。而在腫瘤組織部位,大部分的腫瘤細胞膜表面堿性磷酸酶含量較低,且腫瘤細胞因缺氧等代謝異常行為導致其間液p H呈偏酸性,不利于堿性磷酸酶發(fā)揮作用,因此,氨磷汀無法快速有效的在腫瘤部位水解而影響腫瘤治療的效果。因氨磷汀與ROS的反應是不可逆的消耗性的,而產生的大量ROS需要極高血藥濃度的氨磷汀進行中和;同時,由于氨磷汀的活性代謝產物極不穩(wěn)定,且易被腎臟快速清除,因此,為得到理想的治療效果,臨床上的氨磷汀使用劑量常常達到人的最大耐受劑量,從而導致使用氨磷汀的患者常會遭受劑量依賴的毒副作用,如一過性低血壓,惡心和嘔吐等,也使得氨磷汀的使用存在極大的局限性。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一種FDA批準的可降解生物材料,它可以與不同種類藥物結合,改善藥物的藥代動力學、藥效學和安全性指標。聚乙二醇修飾廣泛應用于多種治療試劑,如蛋白或多肽藥物、小分子藥物以及納米化的藥物輸運系統。聚乙二醇修飾能夠改善不同藥物試劑的溶解性、免疫原性、酶解特性以及體內的生物分布、網狀內皮吞噬作用和腎臟清除率等。因此,小分子藥物與聚乙二醇分子連接后,其體內循環(huán)半衰期和生物利用度均可得到提升。目前,有關氨磷汀的聚乙二醇化修飾還沒有任何報道。于是,我們選擇帶有功能性末端的聚乙二醇對氨磷汀不參加反應的氨基末端進行修飾。由于直鏈聚乙二醇分子只能于其一端或兩端載帶一個或兩個氨磷汀分子,且聚乙二醇與氨磷汀之間的分子量存在較大差異,因此,為提高氨磷汀的載帶率,我們選擇了四臂的聚乙二醇進行研究。在此工作中,我們通過琥珀酰亞胺活性酯與氨基的高效反應,構建了共價連接的四臂聚乙二醇化氨磷汀,并對其結構、形貌以及水解活力進行了表征。并且進一步檢測了聚乙二醇化氨磷汀的細胞攝取能力、細胞毒性、抗氧化能力以及其體內、外的藥效學評價。具體的實驗結果如下:四臂聚乙二醇連接氨磷汀的效率約為75%,即平均一分子的聚乙二醇末端共價連接了三分子的氨磷汀。氨磷汀與聚乙二醇連接后,由于分子纏繞及靜電作用等因素,聚乙二醇化氨磷汀相互纏繞,形成團簇狀球形納米顆粒。這一形貌的變化預示著聚乙二醇化修飾改變了游離氨磷汀所具備的一系列理化特性。首先,氨磷汀能夠在堿性磷酸酶催化作用下快速水解,生成含有自由巰基的活性代謝產物,而聚乙二醇修飾后的團簇狀納米顆粒結構改變了其在堿性磷酸酶催化下的反應速率,使氨磷汀的快速水解特性變?yōu)榭煽氐木徛尫胚^程。提示了其可能在體內具有長效穩(wěn)定的抗氧化保護作用。在細胞攝取行為中,我們發(fā)現聚乙二醇化的氨磷汀與游離的氨磷汀小分子自由擴散進入胞內的方式不同,它可能是通過細胞內吞作用進入細胞內并定位于酸性溶酶體中的。在胞吞過程中,聚乙二醇化氨磷汀與細胞膜接觸的時間延長,使其能夠充分的與膜表面堿性磷酸酶接觸,最大程度的釋放有效的抗氧化巰基末端。在安全性評價研究中,游離氨磷汀具有較嚴重的細胞毒性,且這一細胞毒性可通過抑制堿性磷酸酶活性而得到緩解,說明其損傷因素主要為氨磷汀脫磷酸水解后所產生的活性代謝產物。而在同樣的條件下,聚乙二醇化氨磷汀卻對細胞生長幾乎沒有影響。氨磷汀活性代謝產物中的自由巰基在氧化損傷的過程中,是起到抗氧化保護作用的主要成分。而對于ROS水平較低的組織細胞,大量的小分子自由巰基易于發(fā)生自由擴散,并與細胞組織中生物大分子結合,破壞其生物結構,因而產生較嚴重的細胞毒性。而聚乙二醇化修飾給固定化的氨磷汀巰基末端提供了空間位阻并限制了它的自由運動,減少并阻礙了其末端自由巰基與生物大分子的接觸,從而降低了氨磷汀的細胞毒性。在評價抗氧化能力的研究中,我們通過雙氧水刺激細胞產生大量ROS進而構建了氧化損傷模型。聚乙二醇化氨磷汀在與細胞共孵育的24h內,均可保護其不受ROS的傷害,展示出穩(wěn)定高效的抗氧化能力。相反,氨磷汀對細胞的保護時間更短,且長時間孵育還會刺激細胞產生更高水平的ROS。二者對化療藥物損傷的細胞的保護作用具有類似的結果。我們發(fā)現,聚乙二醇化氨磷汀同樣能夠選擇性保護細胞膜表面高表達堿性磷酸酶的細胞,使其免受化療藥物順鉑的損傷,而對細胞膜表面低表達堿性磷酸酶的細胞幾乎無保護作用。聚乙二醇化氨磷汀展現了極優(yōu)的體外安全性及藥效學特性,于是我們進一步驗證了其體內的生物學活性。聚乙二醇化修飾增加了氨磷汀的分子量,因此,在體內應用之前,我們首先確定了它的體內安全劑量,這一安全劑量中所包含的有效氨磷汀的量僅約為游離氨磷汀體內使用劑量的十分之一。我們利用熒光素模擬氨磷汀,檢測了聚乙二醇化氨磷汀的體內分布,發(fā)現其在腎臟中含量最多且滯留時間較長。在給予化療藥物順鉑的小鼠體內,注射聚乙二醇化氨磷汀能夠完全逆轉由順鉑引起的腎臟脂質過氧化損傷。而游離的氨磷汀非但沒有產生保護活性,還加重了腎臟的損傷程度。隨后,我們評價了氨磷汀與聚乙二醇化氨磷汀在小鼠受到放射性損傷后,對動物骨髓中淋巴細胞的保護效果。無論是游離的還是經過修飾的氨磷汀,其對骨髓淋巴細胞都有一定程度的保護作用,但是并未完全消除掉輻射所引起的細胞損傷。綜上,我們的工作第一次以聚乙二醇為骨架對氨磷汀進行修飾,并發(fā)現聚乙二醇化氨磷汀相比游離的氨磷汀具有更優(yōu)的體內、外安全性及生物活性,這些優(yōu)勢使得聚乙二醇化氨磷汀在臨床轉化應用過程中具有極大的發(fā)展前景。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R943

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本文編號：1269740