本文關(guān)鍵詞：遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥鉀通道致病基因捕獲驗證和海馬氫質(zhì)子波譜改變

  更多相關(guān)文章： GEFS~+ KCNQ_4 突變 目標(biāo)基因捕獲 膜片鉗 氫質(zhì)子波譜

【摘要】：遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥(Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)是一個以常染色體顯性遺傳為主的癲癇綜合征,其基因型和表型具有很大的異質(zhì)性。目前已知的致病基因主要是鈉離子通道基因,仍有很多致病基因不明,很多未知致病基因或易感基因需進一步發(fā)掘和探索。本研究主要對于GEFS+家系鉀通道致病基因研究,應(yīng)用二代測序加目標(biāo)基因靶向捕獲對鉀通道基因捕獲、然后進行相關(guān)功能驗證,尋找GEFS+的致病基因,繼而探討GEFS+與海馬氫質(zhì)子波譜(～H Magnetic resonance spectroscopy,MRS)改變的關(guān)系。研究對象及方法收集2012年1月～2016年12月就診于廣東省人民醫(yī)院小兒癲癇�？崎T診及病房GEFS+患兒,據(jù)2001年國際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)的癲癇及癲癇綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)和GEFS+定義。收集14個GEFS+家系,先證者14人及家系成員共48人,行二代測序加癲癇目標(biāo)基因靶向捕獲技術(shù)檢測。在一個GEFS+家系發(fā)現(xiàn)KCNQ4基因的錯義突變(P537S),應(yīng)用以上技術(shù)再在另13個GEFS+家系和26個熱性驚厥(Febrile seizures,FS)先證者及家系驗證,通過Sanger測序?qū)Πl(fā)現(xiàn)的KCNQ4突變位點在200例健康人群驗證。選取KCNQ4P537S構(gòu)建質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細胞,通過熒光定量PCR比較KCNQ4P537S與KCNQ4野生型組(WT)mRNA水平,Westernblot比較KCNQ4P537S與KCNQ4WT蛋白水平,構(gòu)建Kv7.4P537S純合及Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT雜合通道,再通過全細胞膜片鉗檢測Kv7.4 P537S電流與野生型的差異。在此基礎(chǔ)上,14例GEFS+先證者行海馬MRS檢查,計算雙側(cè)海馬NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/(Cho+Cr)值與對照組比較。結(jié)果1.在14個GEFS+家系中,發(fā)現(xiàn)一個KCNQ4基因突變c.1609CT,位于外顯子12上,可導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生如下變異:p.Pro537Ser(脯氨酸→絲氨酸)。另26個FS家系驗證中又發(fā)現(xiàn)KCNQ4兩個突變:c.1177GT、c.1207GA位于外顯子9上,可分別導(dǎo)致以下蛋白質(zhì)變異:p.Gly393Cys(甘氨酸→半胱氨酸),p.Ala403Thr(丙氨酸→蘇氨酸)。每個病人僅攜帶其中一個突變。以上位點國內(nèi)外未見報道。2.GEFS+家系外及健康人群驗證未發(fā)現(xiàn)以上突變。3.熒光定量PCR:KCNQ4 P537S mRNA相對于KCNQ4WT表達量為0.776852,二組mRNA表達量差異比較p值0.1,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。4.Western blot:KCNQ4P537S蛋白表達量相對于KCNQ4WT蛋白表達量,二組比較差異p值0.0289,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.膜片鉗:細胞膜電壓鉗制于-90mV,階躍刺激從-70mV開始至+60mV,步階 10mV,Kv7.4 P537S 和 Kv7.4 WT 組、Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT 組和 Kv7.4 WT/Kv7.3 WT組鉀離子通道約在電壓-70mv開放,當(dāng)電壓達到50mV左右時通道電流達到峰值,Kv7.4P537S組電流密度為13.27±2.144 pA/pF(n=10),Kv7.4 WT電流密度為25.8±4.147pA/pF(n=8),二者比較P值0.0116,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kv7.4 P537S 組的 I-V 曲線較 Kv7.4 WT 組右移。Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT組電流密度為 32.15 ±2.622 pA/pF(n=8),Kv7.4 WT/Kv7.3 WT 電流密度為 61.69±9.225 pA/pF(n=10),二者比較值 0.0135,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kv7.4 P537S/Kv 7.3 WT組I-V曲線較Kv7.4 WT/Kv7.3 WT組右移。Kv7.4 WT的激活曲線V50為14.3mv,而Kv7.4 P537S為11.3mv,二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Kv7.4 WT/Kv7.3WT 組 V50 為 3.485mv,而 Kv7.4P537S/Kv7.3WT 為 9.955mv,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而且Kv7.4 P537S/Kv7.3 WT激活曲線右移。6.本研究GEFS+患兒雙側(cè)海馬波譜NAA/(Cr+Cho)平均值0.71±0.11,正常對照組0.74±0.10,p值0.214,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論1.發(fā)現(xiàn)一個GEFS+家系KCNQ4基因突變c.1609CT,另26個FS家系驗證中發(fā)現(xiàn) KCNQ4 兩個突變:c.1177GT、c.1207GA。2.KCNQ4P537S影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。3.膜片鉗結(jié)果顯示KCNQ4P537S對細胞膜電位產(chǎn)生影響,電流密度下降,細胞膜上離子通道開放的數(shù)目減少,細胞膜復(fù)極過程延長,對神經(jīng)元興奮活動抑制下降,從而引起神經(jīng)元興奮性增高,引起癲癇的發(fā)生。4.KCNQ4可能是中國人群GEFS+的新的突變基因。5.本研究GEFS+患兒海馬功能磁共振(MRS)未見改變。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

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