本文關鍵詞：二代測序技術應用于手足口病病原譜的研究

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【摘要】：手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒(Enterovirus,EV)引起的一種常見于5歲以下兒童的急性傳染病。近年來,手足口病在我國呈持續(xù)性散發(fā)或暴發(fā)態(tài)勢,有大量研究表明非EV71非CVA16的其他腸道病毒取代了 EV71和CVA16的主要地位,逐漸成為引起手足口病的優(yōu)勢病原。由于其他腸道病毒的型別多種多樣,單一或混合感染情況復雜多變,這給手足口病病原的準確診斷帶來了極大挑戰(zhàn)。另外,在手足口病重癥和輕癥病例中,EV71/CVA16/其他腸道病毒通用型檢測均為陰性的病例數(shù)逐漸增多,其病原信息尚不明確,也尚無相關研究報道。因此應用一種精準的診斷技術來闡明手足口病重癥與輕癥病例的病原譜信息極為迫切和必要。二代測序技術作為精準醫(yī)學的主流手段,不依賴于已知序列信息,可對某一生境中的所有微生物核酸序列進行并行測序和深入細致全貌的分析,尤其適用于病原復雜的手足口病。但因其運行成本高昂、操作繁瑣、數(shù)據(jù)分析瓶頸和臨床樣本中的高背景問題,難以在臨床診斷中推廣使用。本研究首先利用分子條形碼標識寡核苷酸引物(隨機六聚體和非核糖體六核苷酸)和一管式無片段化DNA池文庫的策略,建立了操作簡便、成本低廉、直接鑒定病毒的快速二代測序平臺。采用三種已知病毒進行模式試驗,結果顯示,分子條形碼標識的寡核苷酸引物能夠捕獲到病毒序列信息,其中非核糖體六核苷酸引物捕獲到的病毒序列占比和獲得的模式病毒短序列的基因組覆蓋度均稍高于隨機六聚體引物。這表明非核糖體六核苷酸引物更適合用于病毒樣本的檢測。進而,利用20份手足口病臨床樣本對基于分子條形碼標識非核糖體六核苷酸引物的二代測序平臺進行驗證分析,結果顯示,該方法能準確捕獲到手足口病病毒病原信息并對其進行型別鑒定,同時還能鑒定出其他潛在病毒和甄別臨床誤診事件。這些結果表明,基于分子條形碼標識寡核苷酸引物的二代測序平臺直接鑒定臨床樣本的病毒病原切實可行。為全面了解手足口病重癥與輕癥病例的病毒病原譜信息,以分析重癥與輕癥病例在病原構成上的差異和試圖探索引起重癥病例的病原學因素,本研究應用以上建立的二代測序平臺分別對94份重癥病例和150份輕癥病例臨床樣本進行了測序分析。結果顯示,手足口病樣本中的病毒信息覆蓋了哺乳動物病毒科和植物病毒科共 13 種病毒科的成員:Picornaviridae,Caliciviridae,Paramyxoviridae,Orthomyxoviridae,Parvoviridae,Astroviridae,Adenoviridae,Reoviridae,Anelloviridae,Virgaviridae,Alphaflexiviridae,Tymoviridae 和 Tombusviridae。其中,輕癥病例的病毒組分比重癥病例更為復雜。在輕癥病例中檢測到源于12個病毒科的38個病毒,而在重癥病例中則檢測到源于7個病毒科的21個病毒。同時,在手足口病樣本中還檢測出了多種腸道病毒不同型別之間、腸道病毒與非腸道病毒之間的混合感染事件。所有病毒均通過分子生物學方法進行再次驗證,經(jīng)卡方檢驗對病毒陽性檢出病例數(shù)進行統(tǒng)計學分析,發(fā)現(xiàn)腸道病毒與呼吸道相關病毒的共存事件易發(fā)生于手足口病重癥病例(P=0.001),而腸道病毒與引起腹瀉相關病毒的共存事件易發(fā)生于輕癥病例(P0.001)。另外,利用生物信息學方法對二代測序數(shù)據(jù)組裝獲得的札如病毒全基因組序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析,進化樹表明這株病毒為我國當前的流行毒株�？傊�,本研究成功建立了直接鑒定病毒的二代測序平臺,首次對隨機六聚體引物和非核糖體六核苷酸引物捕獲病毒信息的能力進行了比較分析,并應用該平臺首次初步闡明了手足口病重癥與輕癥病例的病毒病原譜,揭示了引起手足口病的腸道病毒多樣性和混合感染的復雜性,為手足口病的臨床診斷提供了一種精準檢測方法,也為手足口病病原和相關疫情的確診初步提供了數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù),對手足口病的預防控制具有重大意義。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R725.1

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