發(fā)布時間：2017-12-08 07:34

  本文關鍵詞：蝙蝠蛾擬青霉液體發(fā)酵菌絲體多糖對實驗性糖尿病保護作用探討

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【摘要】：蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces Hepiali)是天然冬蟲夏草中分離獲得的內(nèi)寄生菌,藥理活性顯著,早在2001年衛(wèi)生部發(fā)布的《可用于保健食品的真菌菌種名單》中,蝙蝠蛾擬青霉就已被批準為保健食品真菌。大量研究表明,蝙蝠蛾擬青霉菌絲體具有與冬蟲夏草相似的活性組成及藥理藥效。本研究采用化學誘變的方法對蝙蝠蛾擬青霉菌株進行誘變篩選,并探究誘變菌株菌絲體胞內(nèi)多糖對實驗性糖尿病保護作用,為蝙蝠蛾擬青霉作為新型抗糖尿病藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。提升大型真菌發(fā)酵水平的兩個非常有效的途徑是改良菌株遺傳特性和改善菌株發(fā)酵工藝過程。在本研究中,采用亞硝基胍對蝙蝠蛾擬青霉菌株進行誘變選育,以菌絲體干重為考察指標,通過高通量篩選技術篩選獲得蝙蝠蛾擬青霉高產(chǎn)菌株PH40。該菌株可穩(wěn)定遺傳十代以上,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。檢測該菌株生長曲線可知,蝙蝠蛾擬青霉PH40最佳搖瓶培養(yǎng)時間為96 h;采用化學計量學方法,優(yōu)化獲得蝙蝠蛾擬青霉PH40最佳搖瓶培養(yǎng)基配方為:葡萄糖21.9 g/L,酵母浸粉15.74 g/L,蛋白胨10 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,氯化鈉0.5 g/L,氯化鋅0.011 g/L,維生素B1 0.1 g/L。在此條件下,蝙蝠蛾擬青霉最大搖瓶菌絲體產(chǎn)量達25.24 g/L,是未優(yōu)化的1.4倍。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)與小劑量STZ注射聯(lián)合誘導的方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,建模成功大鼠連續(xù)4周灌胃蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物(PHC)或鹽酸二甲雙胍(Met)進行治療,考察PHC對大鼠糖尿病及腎病并發(fā)癥的保護作用。結果顯示,與模型組相比,PHC顯著緩解糖尿病引起的大鼠體重下降,降低大鼠空腹血糖值及糖化血紅蛋白水平,同時,給藥組大鼠血漿總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著降低,證明PHC具有顯著的降血糖及降血脂活性。PHC有效提高大鼠血漿胰島素及丙酮酸激酶含量,促進糖原合成,加速血漿葡萄糖代謝。同時,PHC顯著抑制糖尿病大鼠血漿及腎臟組織中白介素-2、白介素-6、白介素-10、腫瘤壞死因子-α分泌,增加血漿白蛋白水平,證明其對大鼠糖尿病腎病具有很好的緩解和治療作用。與模型組相比,PHC有效降低大鼠腎臟組織核轉錄因子-κB(NF-κB)水平,推測其可能通過NF-κB相關信號通路實現(xiàn)對糖尿病大鼠腎臟組織的保護作用。多糖是真菌菌絲體內(nèi)重要的組成成分,具有顯著的藥理活性。在本研究中,以多糖提取率為響應值,采用化學計量學方法優(yōu)化獲得蝙蝠蛾擬青霉菌絲體胞內(nèi)多糖最佳水提工藝為:提取溫度79.18℃,提取時間3.94 h,液料比46.56:1,通過回歸方程預測得到最優(yōu)的多糖提取率為13.08%。較為優(yōu)化前,多糖提取率顯著上升。采用乙醇醇沉、DEAE-52離子交換層析、Superdex G200凝膠柱層析等方法對蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提液進行分離純化,篩選獲得純化多糖(PHEA)。高效液相色譜檢測結果顯示,PHEA為均一單峰,具有良好的均一性,其平均分子量為3011.47 k Da;單糖組成分析結果顯示,PHEA主要單糖組成為D-阿拉伯糖、D-甘露糖及D-葡萄糖,其分子組成比為2.65:1:1.04;紫外光譜掃描結果顯示,PHEA在260 nm及280 nm波長情況下均無特征吸收峰,證明其組分中不含有核酸及蛋白質,組成單一;紅外光譜掃描結果顯示,PHEA中存在明顯的-OH、C-H、C=O特征吸收峰,及C-O-C、C-O-H、吡喃環(huán)等骨架鏈接;高碘酸氧化及Smith降解實驗顯示,PHEA中可能包含(1→2)-糖苷鍵、(1→4)-糖苷鍵及(1→6)-糖苷鍵連接。為了進一步考察蝙蝠蛾擬青霉菌絲體純化多糖PHEA抗糖尿病及腎病并發(fā)癥活性,采用db/db小鼠模型,連續(xù)8周灌胃給予PHEA或鹽酸二甲雙胍,給藥期間,每周檢測小鼠空腹血糖及體重變化。結果顯示,與模型組相比,PHEA有效降低db/db小鼠體重增長速度、空腹血糖值及糖化血紅蛋白水平,提高小鼠血漿葡萄糖代謝速度,降低攝食后血糖峰值,緩解由高血糖引起的小鼠飲食、飲水增加狀況,對小鼠糖尿病癥狀具有很好的改善作用。生化指標檢測結果證實,PHEA顯著提高小鼠血漿胰島素、丙酮酸激酶水平,促進血漿葡萄糖吸收和代謝,抑制糖原合成酶激酶(GSK-3)活性,增加機體糖原合成,抑制糖原分解,降低小鼠血漿甘油三酯、總膽固醇水平,提高高密度脂蛋白膽固醇含量,改善小鼠脂代謝紊亂,具有顯著的降血糖及降血脂活性。PHEA顯著提高小鼠血漿及腎臟組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶活性,降低丙二醛及腎臟組織中活性氧簇含量,降低機體氧化應激。同時,PHEA有效降低小鼠腎臟組織細胞間黏附分子-1、卷曲蛋白-6、單核細胞趨化蛋白-5、白介素-1β、粒細胞集落刺激因子等炎癥因子水平,抑制腎臟組織中AKT、GSK-3β、NF-κB、信號傳導與轉錄激活因子等蛋白的活性表達,提高CAT、血紅素氧合酶1、核因子相關因子2等蛋白表達水平,緩解高血糖引起的組織氧化應激及炎癥因子損傷,實現(xiàn)其對實驗性糖尿病小鼠腎臟組織的保護作用。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R965

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本文編號：1265582