本文關(guān)鍵詞：人參皂苷Rb1促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠軸突再生及其機(jī)制研究

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【摘要】：腦卒中是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一,據(jù)最新統(tǒng)計,在我國腦卒中致死率已位居所有病因的首位。同時,目前中國腦血管病發(fā)病率亦居世界首位,高于美國近1倍。其中缺血性腦卒中占總數(shù)的80%~85%。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示,缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點,在幸存的腦卒中患者中,尤其是致殘的患者,其健康和生存質(zhì)量受到嚴(yán)重影響,并給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后常表現(xiàn)出神經(jīng)功能一定程度的恢復(fù),提示腦組織具有一定程度的自我修復(fù)能力。這種自我修復(fù)能力與神經(jīng)可塑性密切相關(guān),而軸突再生則是神經(jīng)重塑的重要過程。之前通過對動物模型的研究發(fā)現(xiàn),腦梗死后給予適當(dāng)?shù)乃幬锘蜻\動鍛煉等干預(yù)措施,可以刺激腦組織內(nèi)源性軸突再生,有利于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重新連接,以代償一部分失神經(jīng)支配區(qū)域的神經(jīng)功能。因此,尋找適合、有效的藥物以促進(jìn)缺血性腦卒中患者的康復(fù)和預(yù)后,提高生存質(zhì)量,一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點和方向。近年來,祖國傳統(tǒng)中草藥對于卒中治療的積極作用已越來越受到國內(nèi)外的重視,其具有效果明顯、副作用小、多靶點、多方向和多途徑等眾多優(yōu)點,所以我們致力于從中草藥中篩選出有利于卒中恢復(fù)的藥物。人參是我國的傳統(tǒng)中藥,被用于多種疾病的治療和預(yù)防。人參皂苷Rb1(GRb1)是人參的主要活性成分,早已被證實可在腦缺血急性期通過抗氧化和抗炎等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。它可通過PKA信號通路促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,還被發(fā)現(xiàn)可在體外實驗中促進(jìn)周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖等。這些作用都與腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。然而人參皂苷Rb1在腦梗死后慢性期的作用以及是否可以促進(jìn)中樞神經(jīng)的軸突再生尚沒有明確的文獻(xiàn)支持。本研究選用雄性C57BL/6小鼠為研究對象,電凝法建立小鼠局灶性大腦中動脈皮層梗死(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型,觀察腦缺血后應(yīng)用GRb1治療后運動功能的恢復(fù)情況、軸突再生的形態(tài)學(xué)變化及生長相關(guān)蛋白-43(GAP43)的表達(dá)、cAMP和PKA的水平以及pkac與p-creb的蛋白表達(dá),以探討grb1是否可以促進(jìn)運動功能恢復(fù)和軸突再生以及其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。同時,我們引入pka抑制劑h89作為對比觀察,以進(jìn)一步確認(rèn)grb1與pka通路的關(guān)系。造模后3天、7天、14天和28天作為實驗觀察時間點。本研究分三部分,現(xiàn)將各部分內(nèi)容分別概述如下。第一部分人參皂苷rb1對局灶性腦梗死小鼠運動功能恢復(fù)的作用目的:通過觀察局灶性腦梗死小鼠運動功能恢復(fù)的情況,研究grb1在腦梗死后慢性期對運動功能的恢復(fù)是否具有促進(jìn)作用以及起效時間。方法:選用成年雄性c57bl/6小鼠為研究對象,采用電凝法制備大腦中動脈皮層梗死模型。隨機(jī)將c57bl/6小鼠分為5組:假手術(shù)組(sham)、梗死組(mcao)、grb1治療組(grb1)(mcao+grb1,50mg/kg)、h89干預(yù)組(m+h)(mcao+h89,2μl,i.c.v.)、grb1和h89干預(yù)組干預(yù)組(m+h+g)(mcao1+h89++grb1)。sham組:假手術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。mcao組:術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。grb1組:術(shù)后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。m+h組:術(shù)前給予腦室注射h89溶液2μl,術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。m+h+g組:術(shù)前給予腦室注射h89溶液2μl,術(shù)后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。給藥或溶劑次數(shù)為每日一次,持續(xù)至術(shù)后14天。于術(shù)后3天、7天、14天和28天進(jìn)行rotarod實驗和平衡木腳步失誤實驗。結(jié)果:1rotarod實驗:sham組幾乎沒有運動功能缺損表現(xiàn),平均跑輪時間大于300s,而其它各組平均跑輪時間均低于300s。與mcao組相比,grb1組跑輪時間在術(shù)后14天和28天更長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);m+h組與m+h+g組在術(shù)后7天、14天、28天均低于mcao組(p0.05),并且這兩組之間沒有明顯的差異(p0.05);2平衡木腳步失誤實驗:sham組在行走中幾乎沒有腳步失誤,而其它各組均出現(xiàn)不同程度的腳步失誤。grb組腳誤次數(shù)在術(shù)后7天、14天和28天少于mcao組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);而m+h組與m+h+g組在術(shù)后7天、14天和28天的腳誤次數(shù)均多于mcao組(p0.05),并且這兩組之間沒有明顯的差異(p0.05)。第二部分人參皂苷rb1對局灶性腦梗死小鼠軸突再生的影響目的:觀察腦缺血梗死后皮層內(nèi)軸突再生的變化,研究grb1在腦梗死后慢性期是否具有促進(jìn)軸突再生的作用。方法:以成年雄性c57bl/6小鼠為研究對象,采用電凝法制備大腦中動脈皮層梗死模型。隨機(jī)將c57bl/6小鼠分為2組:a組和b組,每組又分為5個亞組:假手術(shù)組(sham)、梗死組(mcao)、grb1治療組(grb1)(mcao+grb1,50mg/kg)、h89干預(yù)組(m+h)(mcao+h89,2μl,i.c.v.)、grb1和h89干預(yù)組(m+h+g)(mcao1+h89++grb1)。sham組:假手術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水;mcao組:術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水;grb1組:術(shù)后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg;m+h組:術(shù)前給予腦室注射h89溶液2μl,術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水;m+h+g組:術(shù)前給予腦室注射h89溶液2μl,術(shù)后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。給藥或溶劑次數(shù)為每日一次,持續(xù)至術(shù)后14天。術(shù)后14天對b組小鼠健側(cè)感覺運動皮層注射生物素葡聚糖安(bda,2μl)。a組分別于術(shù)后3天、7天、14天和28天取材并應(yīng)用免疫熒光法觀察梗死周圍皮層內(nèi)gap43的表達(dá);應(yīng)用westernblot和qrt-pcr的方法檢測梗死周圍皮層內(nèi)gap43蛋白水平和mrna水平。b組于術(shù)后28天取材,應(yīng)用免疫組化法和免疫熒光觀察雙側(cè)皮層內(nèi)被bda標(biāo)記的神經(jīng)元或軸突,應(yīng)用免疫熒光雙染觀察梗死周圍皮質(zhì)內(nèi)bda與gap43共定位情況。結(jié)果:1a組梗死周圍皮層gap43熒光表達(dá):與mcao組相比,grb1組在術(shù)后7天、14天和28天增多,同時m+h組與m+h+g組表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),m+h+g組表達(dá)在術(shù)后7天和14天多于m+h組(p0.05);sham組始終低表達(dá),且低于mcao組(p0.05);2a組梗死周圍皮層gap43蛋白和mrna表達(dá)趨勢基本一致:與mcao組相比,grb1組在術(shù)后7天、14天和28天升高;m+h組與m+h+g組在術(shù)后7天、14天表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),m+h+g組表達(dá)在術(shù)后7天和14天多于m+h組(p0.05);sham組始終低于mcao組;3b組免疫組化染色觀察可發(fā)現(xiàn)各缺血組的健側(cè)和缺血側(cè)皮層有一定量bda標(biāo)記的神經(jīng)元或軸突纖維,sham組只有極少數(shù)bda標(biāo)記的神經(jīng)元和軸突;4b組通過免疫熒光染色統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)grb1組小鼠健側(cè)皮層內(nèi)被標(biāo)記的神經(jīng)元和軸突的數(shù)目略高于其它組(p0.05),除sham組較少外,其余各組無顯著差異(p0.05);缺血側(cè)皮層內(nèi)被標(biāo)記軸突纖維的數(shù)目:與mcao組相比,grb1組較多,而m+h組與m+h+g組較少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),m+h+g組略多于m+h組(p0.05);sham組數(shù)量較低;5b組觀察梗死周圍皮質(zhì)內(nèi)bda與gap43共定位區(qū)域發(fā)現(xiàn),mcao組共染的陽性面積少于grb1組,但多于m+h組與m+h+g組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),m+h+g組與m+h組并無顯著差異(p0.05);sham組共染陽性面積也低于mcao組。第三部分人參皂苷rb1促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠腦內(nèi)軸突再生與pka信號通路的聯(lián)系目的:觀察局灶性梗死小鼠腦組織內(nèi)pka信號通路相關(guān)分子的變化,研究grb1促進(jìn)梗死后軸突再生的機(jī)制是否與pka信號通路有關(guān)。方法:選用成年雄性c57bl/6小鼠為研究對象,采用電凝法制備大腦中動脈皮層梗死模型。隨機(jī)將c57bl/6小鼠分為5組:假手術(shù)組(sham)、梗死組(mcao)、grb1治療組(grb1)(mcao+grb1,50mg/kg)、h89干預(yù)組(m+h)(mcao+h89,2μl,i.c.v.)、grb1和h89干預(yù)組(m+h+g)(mcao1+h89++grb1)。sham組:假手術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。mcao組:術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。grb1組:術(shù)后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。m+h組:術(shù)前給予腦室注射h89溶液2μl,術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。m+h+g組:術(shù)前給予腦室注射h89溶液2μl,術(shù)后24h腹腔注射grb1溶液50mg/kg。給藥或溶劑次數(shù)為每日一次,持續(xù)至術(shù)后14天。分別于術(shù)后3天、7天、14天和28天取材,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)檢測雙側(cè)大腦皮層內(nèi)camp和pka的水平,應(yīng)用westernblot法檢測雙側(cè)大腦皮層內(nèi)pkac和p-creb蛋白水平。結(jié)果:1大腦皮層內(nèi)的cAMP水平:各缺血組在術(shù)后3天低于sham組;與MCAO組相比,sham組與M+H組在術(shù)后7天和14天水平較低,GRb1組和M+H+G組在術(shù)后7天、14天和28天較高(P0.05);與M+H+G組相比,GRb1組在術(shù)后14天較高,M+H組在術(shù)后7天、14天和28天較低(P0.05);2大腦皮層內(nèi)的PKA水平:各缺血組在術(shù)后3天低于sham組;與MCAO組相比,sham組、M+H+G組和M+H組在術(shù)后7天14天的水平較低,GRb1組則在術(shù)后7天、14天和28天較高(P0.05);與M+H組相比,M+H+G組在術(shù)后7天和14天較高(P0.05);3通過western bolt檢測發(fā)現(xiàn),腦皮層內(nèi)的PKAc與p-CREB的蛋白表達(dá)趨勢基本一致:與MCAO組相比,GRb1組在術(shù)后7天、14天和28天表達(dá)上調(diào),M+H+G組和M+H組在術(shù)后7天、14天和28天表達(dá)下調(diào),M+H+G組的蛋白表達(dá)在術(shù)后7天和14天高于M+H組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1人參皂苷Rb1可促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠在梗死后慢性期的運動功能恢復(fù)。2人參皂苷Rb1可促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠在梗死后慢性期的軸突再生能力。3人參皂苷Rb1促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠在梗死后慢性期的軸突再生的作用可能是通過提升腦組織內(nèi)cAMP的含量,繼而激活cAMP/PKA/CREB信號通路實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 沈雪;玄灄慧;秦i，

本文編號：1265236