本文關(guān)鍵詞：利用免疫分析法解析生—炙甘草對(duì)三種經(jīng)方中主要成分代謝的影響

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【摘要】：甘草來(lái)源于豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖,為臨床常用中藥,其臨床應(yīng)用廣泛。在臨床應(yīng)用中有生甘草與炙甘草之分,特別是古代方劑中生甘草與炙甘草的應(yīng)用區(qū)別明顯,且不可互相代用。生炙甘草第一次有據(jù)可查是源自于《傷寒論》,生炙甘草的不同應(yīng)用是古人臨床實(shí)踐的結(jié)果。本論文利用中藥小分子單克隆抗體技術(shù),建立甘草酸、芍藥苷、葛根素在小鼠血中含量檢測(cè)的免疫分析法,研究蜂蜜對(duì)甘草中甘草酸代謝的影響,并研究生-炙甘草對(duì)芍藥甘草湯、四逆散、葛根芩連湯三種經(jīng)方中主要藥味成分配伍的影響,重點(diǎn)從血液和組織層面考察了生-炙甘草與芍藥配伍后對(duì)芍藥苷代謝的不同影響,從代謝的角度利用免疫分析法解析生-炙甘草對(duì)三種經(jīng)方中主要成分代謝的影響,為中藥配伍研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于生-炙甘草的比較研究不少,但尚未有基于免疫分析法的生-炙甘草對(duì)經(jīng)方藥味代謝影響差異的比較研究。目的:建立甘草酸、芍藥苷、葛根素三種中藥小分子成分在小鼠血中含量檢測(cè)的免疫分析法,同時(shí)建立芍藥苷在心肝脾肺腎組織中含量檢測(cè)的免疫分析法,初探蜂蜜對(duì)甘草酸在小鼠血中藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征的影響,進(jìn)而解析生-炙甘草劑量變化對(duì)芍藥甘草湯、四逆散及葛根芩連湯中重要藥味芍藥苷或葛根素的藥代動(dòng)力特征的影響。方法:1.建立基于甘草酸單克隆抗體的甘草酸在小鼠血中的酶聯(lián)免疫分析法,并進(jìn)行方法學(xué)考察,包括線性、特異性、精密度、準(zhǔn)確性、回收率和穩(wěn)定性等;合成甘草酸單克隆抗體與量子點(diǎn)的結(jié)合物,研究量子點(diǎn)對(duì)甘草酸酶聯(lián)免疫分析法的影響,并首次建立基于量子點(diǎn)的甘草酸酶聯(lián)免疫分析法;2.分別考察蜂蜜對(duì)甘草提取物及甘草酸單體,給昆明小鼠灌胃給藥后,小鼠血中甘草酸代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化,并進(jìn)一步研究蜂蜜中主要成分(葡萄糖、果糖、蔗糖及三種糖的混合物)對(duì)甘草酸代謝的影響:3.建立基于芍藥苷單克隆抗體的芍藥苷在小鼠血中及組織(心肝脾肺腎)中的酶聯(lián)免疫分析法,對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察,包括線性、特異性、精密度、準(zhǔn)確性、回收率和穩(wěn)定性等;從藥代動(dòng)力學(xué)角度基于血液和組織層面考察生-炙甘草與芍藥配伍后對(duì)芍藥苷藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響,并從藥效學(xué)角度借助熱板法觀察生-炙甘草與芍藥配伍后對(duì)芍藥苷鎮(zhèn)痛效果的影響;4.建立基于芍藥苷單克隆抗體的芍藥苷在小鼠血中的酶聯(lián)免疫分析法,對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察,包括線性、特異性、精密度、準(zhǔn)確性、回收率和穩(wěn)定性等;解析生-炙甘草分別對(duì)四逆散中芍藥苷的藥代動(dòng)力特征的影響;5.建立基于葛根素單克隆抗體的葛根素在小鼠血中的酶聯(lián)免疫分析法,對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察,包括線性、特異性、精密度、準(zhǔn)確性、回收率和穩(wěn)定性等;解析生-炙甘草分別對(duì)葛根芩連湯中葛根素的藥代動(dòng)力特征的影響。結(jié)果:1.建立了 PBS中甘草酸的酶聯(lián)免疫分析法,其線性范圍為7.81 ng/mL-250 ng/mL,回歸方程y=-0.1431n(x)+1.2551(R2=0.9918),精密度及準(zhǔn)確性良好,回收率為100.52%-104.02%,適合于甘草提取物中甘草酸的檢測(cè),檢測(cè)穩(wěn)定性良好;2.建立了基于甘草酸單克隆抗體的甘草酸在小鼠血中的酶聯(lián)免疫分析法,其線性范圍為 7.8 ng/mL-250 ng/mL,回歸方程 y =-0.1411n(x)+ 0.9268(R2 = 0.9935),精密度及準(zhǔn)確性良好,回收率為98.04%-103.25%;首次建立了基于量子點(diǎn)的甘草酸酶聯(lián)免疫分析法,量子點(diǎn)稀釋倍比1:1000,其線性范圍為31 ng/mL-4000ng/mL,回歸方程y =-0.074ln(x)+1.0074(R2 = 0.9921),精密度及準(zhǔn)確性良好,回收率為101.6%-113.4%,二者均精密度及準(zhǔn)確性良好,適合于生物樣品的檢測(cè),檢測(cè)穩(wěn)定性良好;3.單獨(dú)灌胃給予小鼠甘草提取物后,血中甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為40min,給予峰蜜與甘草提取物灌胃后,甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間變成240min;單獨(dú)給予甘草酸單體灌胃小鼠后,血中甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為45min,給予峰蜜與甘草提取物灌胃后,甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間變成600min;給予葡萄糖與甘草酸單體灌胃小鼠后,血中甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為45min,給予果糖與甘草提取物灌胃后,甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間變成720min;給予蔗糖與甘草提取物灌胃后,甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間變成45min;給予三種糖的混合物與甘草提取物灌胃后,甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間變成630min;4.建立了基于芍藥苷單克隆抗體的芍藥苷在小鼠血中及組織中的酶聯(lián)免疫分析法,其線性范圍為3.13 ng/mL-1600 ng/mL,精密度及準(zhǔn)確性良好,適合于生物樣品的檢測(cè),檢測(cè)穩(wěn)定性良好。a.生-炙甘草不同劑量組小鼠灌胃給藥后,檢測(cè)血中芍藥苷含量,結(jié)果顯示生甘草高劑量組芍藥苷最大血藥濃度為14.33ug/mL,達(dá)峰時(shí)間為35min,炙甘草高劑量組芍藥苷最大血藥濃度為9.08 ug/mL,達(dá)峰時(shí)間為35min,生甘草中劑量組芍藥苷最大血藥濃度為15.37 ug/mL,達(dá)峰時(shí)間為35min,炙甘草中劑量組芍藥苷最大血藥濃度為12.42 ug/mL,達(dá)峰時(shí)間為35min,生甘草低劑量組芍藥苷最大血藥濃度為11.10ug/mL,達(dá)峰時(shí)間為35min,炙甘草低劑量組芍藥苷最大血藥濃度為7.49ug/mL,達(dá)峰時(shí)間為240min;b.生甘草高劑量組中芍藥苷最大血藥濃度為0.55ug/mg,炙甘草高劑量組中芍藥苷最大血藥濃度為0.06ug/mg,具有非常顯著性差異,其他劑量下不同組織中生-炙甘草對(duì)芍藥苷含量的影響顯示也有不同差異;c.熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示炙甘草中劑量組小鼠對(duì)熱板的反應(yīng)延長(zhǎng)時(shí)間最長(zhǎng),時(shí)間為15.08s,與其對(duì)應(yīng)的生甘草中劑量組小鼠反應(yīng)延長(zhǎng)時(shí)間為12.69s,大部分組別中小鼠達(dá)到最大反應(yīng)延長(zhǎng)時(shí)間的時(shí)間點(diǎn)均在60min,而炙甘草低劑量組中為120min;5.四逆散生甘草組中芍藥苷最大血藥濃度為4949.12ng/mL,達(dá)峰時(shí)間為35min.炙甘草組中芍藥苷最大血藥濃度為6732.46 ng/mL,達(dá)峰時(shí)間為60min;炙甘草組的平均血藥濃度時(shí)間下曲線面積約為生甘草組的1.5倍;6.建立了基于葛根素單克隆抗體的葛根素在小鼠血中的酶聯(lián)免疫分析法,其線性范圍為 3.9-1000 ng·mL-1,回歸方程 y =-0.1661n(x)+1.0016.(R2 = 0.9939)精密度及準(zhǔn)確性良好,回收率為104.08%-107.25%;葛根芩連湯生甘草組中葛根素的最大血藥濃度為74.38ng/mL,炙甘草組中葛根素最大血藥濃度為67.77ng/mL。結(jié)論:1.利用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究蜂蜜對(duì)不同配伍的藥代動(dòng)力學(xué)特征,蜂蜜與甘草提取物或甘草酸單體聯(lián)合給藥后,小鼠血液中甘草酸的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)均受影響,其中最顯著的是對(duì)甘草酸血藥濃度達(dá)峰時(shí)間有延長(zhǎng)作用,在一定程度上驗(yàn)證了"甘則緩之"中醫(yī)理論,且這種延長(zhǎng)作用很大可能是蜂蜜中的果糖引起的;2.以芍藥甘草湯為模板,考察了生-炙甘草與芍藥配伍給藥后對(duì)芍藥苷在小鼠血及組織中代謝動(dòng)力學(xué)特征的影響,發(fā)現(xiàn)炙甘草相比于生甘草對(duì)芍藥苷在血中及組織中均有延緩芍藥苷達(dá)峰時(shí)間的效用;在小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中,炙甘草較之生甘草與芍藥配伍后能顯著延長(zhǎng)小鼠對(duì)熱痛的反應(yīng)時(shí)間,推測(cè)這種效用是蜜制甘草后對(duì)芍藥的影響導(dǎo)致的;驗(yàn)證了中藥配伍中炙甘草對(duì)芍藥的配伍效用;3.進(jìn)一步在多成分復(fù)方四逆散及葛根芩連湯中考察生-炙甘草對(duì)其他藥味的影響,結(jié)果顯示炙甘草較之生甘草對(duì)四逆散中芍藥苷有推遲芍藥苷達(dá)峰時(shí)間的作用;炙甘草較之生甘草對(duì)葛根芩連湯中葛根素有降低其最大血藥濃度的作用,說(shuō)明了炙甘草在不同中藥復(fù)方中均具有一定的緩和作用,主要體現(xiàn)在緩和其他藥味的藥效及其達(dá)峰時(shí)間上,與中醫(yī)配伍理論中炙甘草調(diào)和諸藥相一致。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
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本文編號(hào)：1265209