本文關(guān)鍵詞：miR-877-3p誘導(dǎo)p16基因激活對膀胱癌增殖的抑制作用及其機制探討

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【摘要】：背景:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害患者健康及生存質(zhì)量,加重社會醫(yī)療負(fù)擔(dān),目前已經(jīng)成為了一個重要的公共衛(wèi)生問題。膀胱癌主要來源于泌尿道移行上皮,并具有局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特征。盡管以手術(shù)治療為主,結(jié)合化療、放療、免疫治療等在內(nèi)的綜合治療手段不斷發(fā)展,膀胱癌的預(yù)后及遠(yuǎn)期生存率依舊不容樂觀。膀胱癌的發(fā)生及進展與一系列癌基因異常高表達(dá)、抑癌基因的異常缺失及突變相關(guān),而恢復(fù)異常沉默的抑癌基因在膀胱癌中的表達(dá),使其重獲生物學(xué)調(diào)控功能已成為了目前膀胱腫瘤分子靶向研究的一個關(guān)注點。MicroRNA(miRNA)是一類長度約為19-22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA,它們可以直接靶向編碼基因的特定序列,并通過下調(diào)或上調(diào)該編碼靶基因的表達(dá)來實現(xiàn)其生物學(xué)功能。大量研究證據(jù)表明,miRNA的異常表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生及進展相關(guān)。目的:檢測抑癌基因p16在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,并尋找可以靶向作用于其啟動子區(qū)的miRNA。在膀胱癌細(xì)胞系中評估m(xù)iR-877-3p的表達(dá)情況,并利用定量PCR,Western Blot,啟動子熒光報告技術(shù)及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)證實p16為miR-877-3p的直接作用靶點。在膀胱癌細(xì)胞系T24和UM-UC-3中,采用獲得性功能實驗評價miR-877-3p的生物學(xué)功能,并驗證其功能的實現(xiàn)是經(jīng)由恢復(fù)p16基因的表達(dá)而完成的。方法:1)在膀胱癌細(xì)胞系中檢測p16基因的表達(dá)水平,通過生物信息學(xué)預(yù)測及篩選可能與其啟動子區(qū)存在相互作用的miRNA,并檢測該miRNA在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況;2)通過熒光定量PCR和Western Blot驗證miR-877-3p對p16基因在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)的影響,并利用啟動子熒光報告技術(shù)和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)驗證miR-877-3p對p16啟動子區(qū)的靶向調(diào)控作用;3)通過轉(zhuǎn)染miR-877-3p模擬體(mimic)上調(diào)miR-877-3p在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)來進行獲得性功能實驗,通過CCK-8、平板克隆形成、裸鼠皮下成瘤、細(xì)胞周期等方法評估m(xù)iR-877-3p對膀胱癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響,進一步借助RNA干擾技術(shù)驗證miR-877-3p在膀胱癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能與p16基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:1)p16基因在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),我們使用熒光定量PCR在3株膀胱癌細(xì)胞株(T24,UM-UC-3和5637)中檢測了 p16基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明與正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1相比,3株膀胱癌細(xì)胞中p16的表達(dá)量顯著降低。2)經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測得知,在p16基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1500個堿基區(qū)段內(nèi),miR-877-3p存在著與p16基因啟動子區(qū)相互作用的可能性;熒光定量PCR表明miR-877-3p在膀胱癌細(xì)胞中呈現(xiàn)出顯著的低水平表達(dá);使用5-氮雜-2'-脫氧胞苷治療(5-氮雜胞苷)處理后miR-877-3p在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上升。3)在膀胱癌細(xì)胞T24及UM-UC-3中,我們證實了 miR-877-3p可以在mRNA和蛋白水平提高p16基因的表達(dá)量,且該作用依賴于miR-877-3p序列的完整性;啟動子熒光報告實驗表明,miR-877-3p可以增加p16基因啟動子的活性;染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證實了 miR-877-3p可以特異性的靶向p16基因啟動子區(qū)-299～-320的區(qū)域。4)獲得性功能實驗結(jié)果提示miR-877-3p可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和克隆形成,并且引起細(xì)胞周期G1期的阻滯;此外,miR-877-3p還可以抑制裸鼠皮下成瘤的能力。5)借助RNA干擾技術(shù)在膀胱癌細(xì)胞中抑制p16基因的表達(dá)后,我們發(fā)現(xiàn)miR-877-3p對膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞周期阻滯功能被部分逆轉(zhuǎn),提示miR-877-3p在膀胱癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能是借由激活p16基因的表達(dá)而實現(xiàn)的。結(jié)論:1)膀胱癌細(xì)胞中p16基因及miR-877-3p的表達(dá)量均有顯著下調(diào),miR-877-3p的下調(diào)表達(dá)可能與其啟動子區(qū)的高甲基化相關(guān)。2)miR-877-3p可以特異性的靶向p16基因啟動子區(qū),增加啟動子的活性,并在mRNA水平及蛋白水平升高p16基因在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。3)過表達(dá)miR-877-3p可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、平板克隆形成及裸鼠皮下成瘤能力,同時還可以引起細(xì)胞周期G1期的阻滯。4)miR-877-3p在膀胱癌細(xì)胞中的抑癌作用是通過激活p16基因的表達(dá)而實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

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本文編號：1264967