發(fā)布時(shí)間：2017-12-08 03:10

  本文關(guān)鍵詞：Erbb4調(diào)控心臟再生的分子學(xué)特征

  更多相關(guān)文章： Erbb4 Nrg1 斑馬魚(yú) 新生乳鼠 細(xì)胞周期 心臟再生

【摘要】：一、背景與目的斑馬魚(yú)及新生乳鼠心臟再生能力的發(fā)現(xiàn)給再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了重要的研究模型及方法。譜系追蹤技術(shù)于再生領(lǐng)域的應(yīng)用證實(shí),斑馬魚(yú)及新生乳鼠心臟損傷后再生的心肌細(xì)胞均主要來(lái)源于損傷區(qū)尚存心肌細(xì)胞的去分化及增殖。成人等成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞多已退出細(xì)胞周期,自然狀態(tài)下無(wú)法發(fā)生去分化及增殖,這可能就是其心臟再生能力十分有限的原因。因此明確心肌細(xì)胞去分化及增殖的病理生理機(jī)制成為自然心臟再生研究的關(guān)鍵所在。Gemberling等人研究表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin1,Nrg1)是種強(qiáng)力的促心肌細(xì)胞分裂因子,即使沒(méi)有心臟損傷也可以激活斑馬魚(yú)心臟再生進(jìn)程。并且在未受損傷心室中他們也檢測(cè)到erbb2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)及erbb4b(erb-b2 receptor tyrosine kinase 4)在m RNA水平的表達(dá),進(jìn)而發(fā)現(xiàn)通過(guò)化學(xué)抑制劑阻斷Erbb2受體可以抑制斑馬魚(yú)心臟再生時(shí)的心肌細(xì)胞增殖。Bersell等人對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn),Nrg1可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期重啟而促進(jìn)成鼠心臟再生及心梗后心功能恢復(fù),而Erb B4是Nrg1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞周期重啟必不可少的受體。該研究還發(fā)現(xiàn)Nrg1可以刺激單核心肌細(xì)胞增殖,但對(duì)多核細(xì)胞作用明顯減弱。而單核心肌細(xì)胞正是斑馬魚(yú)及新生7日(7days postnatal,P7)內(nèi)小鼠的主要心肌細(xì)胞類(lèi)型。新生小鼠在P7后失去心臟再生能力,這與心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期的時(shí)間窗吻合。有趣的是,近期也有研究表明乳鼠出生后Erb B2受體表達(dá)顯著降低,而此時(shí)Nrg1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖作用也明顯下降,提示Erb B2受體的減少可能是成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞對(duì)Nrg1反應(yīng)性下降的一個(gè)原因。Nrg1是一種細(xì)胞外生長(zhǎng)因子,其受體為具有跨膜結(jié)構(gòu)的酪氨酸激酶家族,包括Erb B1,2,3,4。Erb B受體在Nrg1的誘導(dǎo)下可以形成二聚體,激活胞內(nèi)區(qū)域磷酸化而發(fā)揮活性作用。Erb B4是該家族受體中唯一既能與Nrg1直接結(jié)合又可發(fā)揮其酪氨酸激酶活性的受體,而Erb B2是一種共受體,并不能直接與Nrg1結(jié)合。另外,由于Erb B4在緊挨跨膜片段的膜外部分存在相對(duì)較長(zhǎng)的“莖稈樣”(stalk)結(jié)構(gòu),在與Nrg1結(jié)合后,Erb B4可從該處發(fā)生蛋白水解斷裂,形成釋放入細(xì)胞外的120KDa的胞外部分以及80KDa的胞內(nèi)部分,該水解過(guò)程需要腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(Tumor Necrosis factor-α-converting enzyme,TACE)的參與。80KDa的胞內(nèi)部分在另一種膜蛋白γ分泌酶的作用下進(jìn)一步水解斷裂而從細(xì)胞膜釋放入胞內(nèi)成為Erb B4-ICD(intracellular domain),進(jìn)而可轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞周期的調(diào)控。雖然目前Nrg1/Erb B信號(hào)通路對(duì)心臟再生的作用已經(jīng)得以明確,但對(duì)Nrg1重啟細(xì)胞周期的作用機(jī)制尚不清楚,其關(guān)鍵的直接受體Erbb4參與細(xì)胞周期重啟并調(diào)控心臟再生的具體作用機(jī)制尚不明確。因此,研究Erbb4受體在心臟中的表達(dá)模式對(duì)于其機(jī)制探索十分重要。本研究將通過(guò)對(duì)比可自然再生的模式生物與不可再生的成年哺乳動(dòng)物心室中Erbb4的表達(dá)差異,結(jié)合Nrg1刺激作用下Erbb4受體的表達(dá)變化,為探索Erbb4重啟細(xì)胞周期的作用機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)資料。二、研究方法(一)斑馬魚(yú)及小鼠實(shí)驗(yàn)操作選用6-8個(gè)月齡的AB野生型斑馬魚(yú)用于成年斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)。本研究使用的已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因魚(yú)系有fli1α1:EGFP,wt1:EGFP,gata4:EGFP,cmlc2:Cre ER,β-act2:lox P-m TagBFP-STOP-lox P-Nrg1(β-act2:BSNrg1)。斑馬魚(yú)心尖切除術(shù)依據(jù)Poss發(fā)表的方法進(jìn)行,分別于3dpa、7dpa及14dpa收集RNA、蛋白及組織學(xué)標(biāo)本,并以未損傷心臟作為對(duì)照。小鼠實(shí)驗(yàn)選取ICR/CD-1型孕鼠及2月齡成鼠。將孕期15日的孕鼠飼養(yǎng)至分娩,分別收集P1、P4、P8及2月齡成鼠心臟組織蛋白。為誘導(dǎo)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞表達(dá)Nrg1,將cmlc2:Cre ER與β-act2:BSNrg1魚(yú)系進(jìn)行雜交,篩選出雙重轉(zhuǎn)基因魚(yú)系。將4-OH-Tamoxifen(4-HT)稀釋于丙二醇中,配制成濃度為10μmol的魚(yú)水并同時(shí)處理40dpf的Tg(cmlc2:Cre ER;β-act2:BSNrg1及β-act2:BSNrg1)斑馬魚(yú),間隔4-5日重復(fù)1次,再過(guò)4-5日后收集心臟。為實(shí)現(xiàn)化學(xué)方法抑制TACE活性,對(duì)成年野生型斑馬魚(yú)行心尖切除術(shù),于2-3dpa使用金屬蛋白酶抑制劑GM6001(濃度為10μM)的魚(yú)水處理,并收集心臟組織蛋白進(jìn)行檢測(cè)。(二)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(q RT-PCR)用TRIzol?以常規(guī)方法抽提uncut、3dpa及7dpa斑馬魚(yú)全心室RNA,用Super Script?III First-Strand synthesis試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA。采用Roche Light Cycler?480Real-Time PCR系統(tǒng)對(duì)erbb4進(jìn)行定量PCR檢測(cè),采集循環(huán)值,單個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)并以斑馬魚(yú)ef1α作為內(nèi)參。使用的引物序列為ef1α:F-AGCTCGTTGGAGTCAAC,R-TGCGCTGACTTCCTTGGTG;erbb4a:F-GTTGTGCCGTCGAACAATAG,R-CTGGCACTGATCCTCCTGA;erbb4b:F-ACTCAACGTGTTTCGCACTG,R-GCTCTGCCTCCAATAGTTGC。收集斑馬魚(yú)及小鼠心臟,去除心室外多余組織,根據(jù)組織體積加入相應(yīng)量的細(xì)胞膜裂解液Buffer A(10 m M HEPES,PH=7.5;10 m M KCl;1 m M EDTA;2 m M Mg Cl2,1%NP40),勻漿并于500g×5min離心,吸取上清即為細(xì)胞漿蛋白。復(fù)洗后剩余部分加入50μl細(xì)胞核裂解劑Buffer B(Buffer A基礎(chǔ)上加500m M Na Cl及25%Glycerol),靜置后12000g高速離心,上清即為核蛋白。(四)蛋白免疫印跡檢測(cè)(Western Blot)采用Western Blot分別檢測(cè)斑馬魚(yú)再生過(guò)程、新生乳鼠及成鼠的全蛋白、核漿分離蛋白中的Erb B4、Tropomyosin、GAPDH的表達(dá)。組織全蛋白標(biāo)本的提取采用RIPA裂解液。各蛋白樣品分別加入4×Sample Buffer及10×Reducing Buffer,配制成1×Sample Buffer。選用濃度為8%的預(yù)制凝膠,并使用iblot?轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜,修剪后用Odyssey Blocking Buffer于室溫下封閉1小時(shí),4°C孵育一抗16小時(shí)。PBST洗滌3次,室溫避光孵育熒光二抗1小時(shí)。PBST洗滌3次后使用Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶信號(hào)。一抗?jié)舛葹?anti-Erb B4(1:1000),antiTropomyosin(1:1000),anti-GAPDH(1:1000)。二抗?jié)舛葹?anti-mouse(1:10000),anti-rabbit(1:10000)。(五)組織免疫熒光檢測(cè)1.組織切片免疫熒光染色將斑馬魚(yú)心臟組織制作成石蠟切片,脫蠟后加熱引導(dǎo)下于VECTOR抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù),隨后使用組織切片封閉液(5%山羊血清,2.5%的馬血清及0.3%Triton X-100,稀釋于TBST)室溫下封閉45min。4°C下孵育一抗16小時(shí),TBST洗滌3次,室溫下孵育二抗1小時(shí),DAPI復(fù)染后封片。使用Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行檢測(cè)并攝圖。一抗及濃度:anti-Erb B4(1:200),anti-EGFP(1:500),antiTropomyosin(1:200)。二抗及濃度:anti-rabbit(1:200),anti-mouse(1:200),antiChicken(1:500),所有的組織切片檢測(cè)均依據(jù)研究員單盲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。2.全心組織熒光染色收集麻醉處死的fli1α:EGFP斑馬魚(yú)心臟,清洗后4°C下于4%的PFA固定24h,并于Dent’s液(25ml H2O2,10ml DMSO,40ml Me OH)漂白24小時(shí),隨后Dent’s固定液(50ml DMSO,200ml Me OH)再次固定24小時(shí)。清洗后孵育一抗5天,洗去一抗并避光條件孵育二抗5天,洗去二抗并于BABB液(50ml benzyl alcohol,100ml benzyl benzoate)進(jìn)行透明化處理后固定于1%瓊脂糖凝膠于共聚焦顯微鏡下攝片。(三)心室組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白分離3.心肌細(xì)胞爬片熒光染色將24孔板中的心肌細(xì)胞爬片于4%PFA/PBS中固定10分鐘,打孔10分鐘后以封閉液封閉30分鐘,隨后一抗4°C下孵育16小時(shí)。PBS洗凈后室溫下避光孵育二抗30分鐘。DAPI復(fù)染后封片,以熒光顯微鏡攝片。一抗及濃度:anti-Erb B4(1:200)或anti-a-actinin(1:300)。二抗及濃度:488 anti-mouse(1:200)。(六)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Western Blot結(jié)果通過(guò)灰度測(cè)量軟件得到計(jì)量資料,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,單組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次及以上。兩組獨(dú)立樣本進(jìn)行t檢驗(yàn),多因素樣本采用方差分析,以P0.05作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。三、研究結(jié)果(一)erbb4在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中的表達(dá)erbb4的m RNA檢測(cè)結(jié)果以ef1a作為內(nèi)參進(jìn)行校正,結(jié)果顯示,在未損傷的斑馬魚(yú)心臟中均有erbb4a及erbb4b的表達(dá)。以未損傷斑馬魚(yú)心臟為對(duì)照,erbb4a及erbb4b的表達(dá)在7dpa時(shí)均顯著下調(diào)。(二)Erbb4在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中的表達(dá)Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明Erbb4在斑馬魚(yú)心臟中主要以約60KDa的截短蛋白(Erbb4-ICD)形式存在,180KDa的全長(zhǎng)蛋白含量相對(duì)較低。為了檢測(cè)Erbb4在空間分布,我們進(jìn)行了免疫熒光染色,并進(jìn)一步分離了核漿蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示Erbb4表達(dá)于全心范圍而心肌細(xì)胞核區(qū)的表達(dá)豐度較高,并且在未損傷心臟及損傷心臟中均有表達(dá)。Western結(jié)果也顯示,在斑馬魚(yú)未損傷的心臟或者再生的心臟中,截短的Erbb4蛋白都主要表達(dá)于細(xì)胞核中,細(xì)胞漿中可檢測(cè)到全長(zhǎng)蛋白及剩余的截短蛋白表達(dá)。斑馬魚(yú)未損傷心臟組織切片及全心掃描結(jié)果的免疫熒光共染色結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞、心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞及心外膜細(xì)胞均可檢測(cè)到Erbb4受體的表達(dá),并且在心肌細(xì)胞內(nèi)的分布主要位于細(xì)胞核區(qū)。(三)Erb B4在新生乳鼠及成鼠心臟中的表達(dá)Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,在小鼠心臟中,Erb B4同樣主要以約60KDa的ICD與180KDa的全長(zhǎng)蛋白兩種形式存在,Erb B4-ICD的表達(dá)量顯著高于全長(zhǎng)蛋白。其中ICD主要分布在細(xì)胞核中,全長(zhǎng)蛋白僅分布于細(xì)胞漿中。從P1到P8,這兩種形式的蛋白表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。與新生乳鼠相比,已退出細(xì)胞周期的成鼠心臟中Erb B4-ICD及全長(zhǎng)蛋白均顯著減少。(四)Nrg1誘導(dǎo)未成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核中Erbb4的表達(dá)乳鼠及成鼠的對(duì)比研究表明心臟中的Erb B4-ICD及全長(zhǎng)蛋白在小鼠心臟晚期發(fā)育階段逐漸減少。為探索斑馬魚(yú)心臟發(fā)育至成熟過(guò)程Erbb4的變化,我們對(duì)比了未成年斑馬魚(yú)與成年斑馬魚(yú)心臟中Erbb4的表達(dá)。組織石蠟切片熒光染色結(jié)果表明,未成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核中Erbb4的表達(dá)水平明顯低于成年斑馬魚(yú)。為探索Nrg1對(duì)Erbb4受體表達(dá)的影響,我們通過(guò)4-HT處理Tg(cmlc2:Cre ER;β-act2:BSNrg1)而誘導(dǎo)40dpf的斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞特異性表達(dá)Nrg1,并以Tg(β-act2:BSNrg1)作為對(duì)照組,對(duì)55dpf的心臟石蠟切片行Erbb4及Tropomyosin的免疫熒光染色。結(jié)果顯示,Erbb4的心肌細(xì)胞核區(qū)染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組,這表明心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nrg1可以誘導(dǎo)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核中Erbb4的表達(dá)。(五)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核內(nèi)ICD可能直接由erbb4翻譯而來(lái)TACE是Erb B4蛋白水解所必要的一種金屬蛋白酶,GM6001為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑,可抑制TACE活性。對(duì)斑馬魚(yú)行心尖切除術(shù)后于2-3dpa予以10μM化學(xué)抑制劑GM6001處理,并提取心臟組織蛋白行的Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,60KDa左右的Erbb4-ICD表達(dá)量未見(jiàn)顯著改變。這提示細(xì)胞核中的Erbb4-ICD可能并非來(lái)自全長(zhǎng)蛋白的水解。對(duì)斑馬魚(yú)erbb4開(kāi)放閱讀框的分析表明,erbb4除了可以翻譯成180KDa的全長(zhǎng)蛋白外,也可以直接翻譯為大小約63KDa的碳-端蛋白,這與我們發(fā)現(xiàn)的60KDa左右的ICD分子量大小基本一致,說(shuō)明核內(nèi)的Erbb4-ICD可能由erbb4以替代起始位點(diǎn)直接翻譯而成。四、結(jié)論(一)Erb B4在可自然再生的斑馬魚(yú)及新生乳鼠體內(nèi)主要有Erbb4-ICD及全長(zhǎng)蛋白兩種形式,并分別存在于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中。(二)在不具備再生能力的成鼠心臟中,Erb B4-ICD及全長(zhǎng)蛋白在對(duì)應(yīng)區(qū)域的表達(dá)顯著降低。(三)未成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核內(nèi)Erbb4的表達(dá)明顯低于成年斑馬魚(yú),心肌細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Nrg1可誘導(dǎo)細(xì)胞核區(qū)的Erbb4表達(dá)顯著增強(qiáng)。由于Erbb4全長(zhǎng)蛋白并不分布于細(xì)胞核中,這表明Erbb4受Nrg1刺激后可能通過(guò)形式或位置的改變來(lái)參與細(xì)胞周期的調(diào)控。(四)抑制斑馬魚(yú)TACE活性,心室中Erb B4-ICD表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化,說(shuō)明細(xì)胞核中60KDa的ICD可能并非主要由全長(zhǎng)蛋白水解而來(lái)。對(duì)斑馬魚(yú)erbb4開(kāi)放閱框的分析對(duì)比表明,細(xì)胞核中的Erbb4-ICD可能由由erbb4以替代起始位點(diǎn)直接翻譯而成。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 盧天蘭;趙振國(guó);阮燕燕;岳偉華;張岱;;精神分裂癥與表皮生長(zhǎng)因子4(ERBB4)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年14期

2 李梓萌;潘超;盧天蘭;阮燕燕;朱日升;王力芳;閻浩;岳偉華;張岱;;精神分裂癥患者探究性眼球軌跡運(yùn)動(dòng)與表皮生長(zhǎng)因子4(ERBB4)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)[J];中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志;2013年04期

3 吐尼沙,呂新全,阿米娜,陳再蓉,羅文偉,吉利力;乳腺不同病變組織中erbB4的表達(dá)及意義[J];河南腫瘤學(xué)雜志;2004年06期

4 李樹(shù)玲;顏慧;宮澤輝;;ErbB4基因miRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建和有效性鑒定[J];軍事醫(yī)學(xué);2012年04期

5 路平,梁秋冬,鄭全慶;宮頸癌中nm23-H1、erbB3、erbB4相關(guān)表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系[J];中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2003年11期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王飛宇;Erbb4調(diào)控心臟再生的分子學(xué)特征[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 湯雄文;ErbB4受體介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：1264811