本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒復(fù)制相關(guān)宿主因子的高通量篩選及血小板因子4抗病毒機制研究

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是感染人類的重要呼吸道病毒,主要感染兒童、老人及免疫力低下人群,可導(dǎo)致包括肺炎和支氣管炎在內(nèi)的嚴(yán)重呼吸道疾病,每年在全球造成3380萬感染病例和6.6～25.4萬死亡病例,是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一。雖然針對RSV的疫苗和治療性抗體研究取得了一定進(jìn)展,但目前尚無商品化的疫苗和高效的抗病毒干預(yù)手段。研究病毒宿主因子有助于發(fā)現(xiàn)新的抗病毒靶點,是當(dāng)前領(lǐng)域內(nèi)研究熱點和重點。目前對RSV在感染過程中如何影響宿主免疫防御已有一定了解,但對宿主因子在RSV感染中的作用研究較少,尤其缺乏在基因組水平上對RSV復(fù)制相關(guān)宿主因子的全面認(rèn)識。為了更全面闡釋RSV復(fù)制相關(guān)宿主因子及其功能,本研究基于含有10001個人類基因cDNA表達(dá)文庫的高通量篩選,分析影響RSV復(fù)制的宿主因子,發(fā)現(xiàn)59個宿主因子與RSV的復(fù)制相關(guān),通過功能驗證,對其中抑制病毒復(fù)制功能最強的血小板因子4(Platelet factor 4,PF4)開展了深入的抗病毒功能與機制研究。在RSV宿主限制因子篩選中,本研究將人cDNA表達(dá)文庫與高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)相結(jié)合,用液體工作站和高內(nèi)涵顯微成像設(shè)備,通過免疫熒光分析病毒蛋白表達(dá)水平,在RSV感染細(xì)胞模型中實現(xiàn)外源基因的過表達(dá)和高通量篩選,分析與RSV復(fù)制相關(guān)的宿主因子。通過實驗條件篩選,獲得了自動化、高通量和信噪比良好(6.7±0.3)的優(yōu)化研究體系,完成10001個人類基因cDNA的篩選。以RSV N蛋白熒光信號強度為指標(biāo),計算感染率并轉(zhuǎn)換為z score,z score的絕對值反映樣本的變異程度,其數(shù)值的正負(fù)反映變異的方向性。細(xì)胞數(shù)量z score≥-3的樣本為有效數(shù)據(jù)。以感染率z score=±2作為閾值,z score2的基因為對RSV復(fù)制有促進(jìn)作用,z score-2的為有抑制作用。篩選共獲得355個與RSV病毒復(fù)制相關(guān)的目標(biāo)基因,其中122個有正調(diào)控作用,233個有負(fù)調(diào)控作用。上述基因經(jīng)二次驗證篩選,確定了細(xì)胞色素C氧化酶組裝因子1同系物(COA1)、泛素樣修飾物激活酶1(UBA1)等10個基因具有正向調(diào)控病毒復(fù)制的作用,γ-干擾素(IFNG)、血小板因子4(PF4)等49個基因具有負(fù)調(diào)控作用。利用Western blot和RT-PCR方法對上述篩選后的基因進(jìn)行功能驗證,確定其對RSVN基因的表達(dá)具有相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)作用。在篩選發(fā)現(xiàn)的RSV限制性宿主因子中,PF4具有較高的病毒感染抑制率。PF4是一種分泌型表達(dá)的細(xì)胞因子,具有調(diào)節(jié)造血功能、促進(jìn)凝血與創(chuàng)傷愈合、免疫調(diào)節(jié)、抗血管新生等多種生理功能,在腫瘤、移植排斥反應(yīng)和放化療導(dǎo)致的造血功能障礙治療中,PF4在動物模型中獲得了較好的效果。目前僅有兩個研究團(tuán)隊報道了 PF4可抑制流感病毒和HIV復(fù)制,對其抗病毒功能的了解還十分有限。為了闡釋PF4抑制RSV病毒復(fù)制的功能機制,首先我們分析了臨床RSV感染嬰幼兒外周血PF4濃度,發(fā)現(xiàn)與無呼吸道感染人群對照比較,其血漿PF4濃度顯著增高(p0.001)。進(jìn)一步我們在細(xì)胞和動物水平對其分析對RSV復(fù)制的作用機制。首先,通過在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)PF4蛋白,發(fā)現(xiàn)RSVN蛋白隨著PF4表達(dá)增加而降低,兩者存在劑量反應(yīng)關(guān)系,而信號肽缺失的非分泌型PF4突變體對RSV復(fù)制無影響;進(jìn)一步在HEp-2細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入重組人PF4蛋白后再感染RSV,發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制受到抑制,且抑制率與PF4濃度呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明分泌型PF4蛋白具有抑制RSV復(fù)制的作用。為確定分泌型PF4對病毒復(fù)制的抑制作用針對于吸附還是穿入階段,我們在病毒吸附前、進(jìn)入階段和進(jìn)入結(jié)束后分別給予PF4處理,發(fā)現(xiàn)只有在吸附前和進(jìn)入階段加入PF4蛋白才能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)RSVN基因表達(dá)水平,在病毒吸附前加入PF4的病毒復(fù)制抑制作用能夠更強,提示PF4主要在RSV吸附階段發(fā)揮作用。PF4可高親和力結(jié)合多種糖胺聚糖,其中包括重要的RSV受體硫酸乙酰肝素(Heparan sμlphate,HS)。因此,我們推測PF4可能通過競爭性結(jié)合細(xì)胞表面HS而阻斷RSV對宿主細(xì)胞的吸附。通過將PF4蛋白與不同濃度的肝素混合后孵育HEp-2細(xì)胞,棄去混合物后再用RSV感染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)RSV感染率隨肝素濃度上升而增加,表明PF4對RSV感染的阻斷依賴于肝素與HS結(jié)合能力;免疫熒光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)HS與PF4和RSV在細(xì)胞膜表面分別存在共定位,但PF4與RSV未見共定位,提示PF4結(jié)合HS后阻斷了 RSV對HS的吸附,限制了病毒的進(jìn)入。用腸道病毒71(HS為其受體之一)和非HS受體依賴的流感病毒W(wǎng)SN為模型的研究,發(fā)現(xiàn)PF4對EV71的復(fù)制也具有抑制作用。以上結(jié)果表明PF4可通過結(jié)合細(xì)胞表面受體HS,阻斷病毒吸附過程,發(fā)揮非特異性的抗病毒作用。在RSV小鼠感染模型中對PF4的抗病毒功能進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)感染RSV小鼠肺部和血漿PF4水平顯著升高(p=0.005);經(jīng)鼻給予PF4能顯著降低小鼠肺部RSV載量,減輕肺部病理損傷,下調(diào)氣道IL-6炎性因子的水平,表明PF4能通過抑制宿主體內(nèi)病毒復(fù)制減輕RSV的病理損傷。上述結(jié)果表明內(nèi)源性PF4在宿主抗RSV感染中可能具有重要作用。本文通過功能獲得性高通量篩選技術(shù),發(fā)現(xiàn)了一批RSV感染相關(guān)宿主因子,為構(gòu)建RSV-宿主相互作用網(wǎng)絡(luò)、闡明RSV感染的調(diào)節(jié)機制提供了理論基礎(chǔ),也為發(fā)現(xiàn)RSV感染相關(guān)的生物標(biāo)志物和新的抗病毒靶點提供了研究方向。對PF4抗病毒機制的研究也首次揭示了其在抗RSV感染中的作用,為深入研究PF4抗病毒功能提供了理論依據(jù)。此外,PF4的抗病毒靶點HS在不同類型的細(xì)胞中廣泛表達(dá),是多種病毒的受體或輔助受體,提示PF4可能具有廣譜抗病毒能力,其抗病毒譜和應(yīng)用潛力還需進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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