本文關(guān)鍵詞：弓形蟲入侵轉(zhuǎn)化過程中宿主Rac1及蟲體DNA甲基化的作用研究

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【摘要】：背景:弓形蟲是一種機(jī)會性致病原蟲,人和其他溫血動物均可通過多種途徑被感染。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程主要包括粘附細(xì)胞膜,納蟲泡(PV)的形成等。中間宿主感染后,弓形蟲可實(shí)現(xiàn)速殖子向緩殖子的轉(zhuǎn)化,形成慢性感染;當(dāng)宿主免疫力低下時,緩殖子則會向速殖子轉(zhuǎn)化,引起急性發(fā)病。目前關(guān)于弓形蟲入侵及速、緩殖子相互轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不完全清楚。宿主Rac1在細(xì)胞骨架重組中扮演著重要的角色,以往研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中Rac1在納蟲泡膜(PVM)上存在聚集現(xiàn)象。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式,主要參與物種表型的可塑性和適應(yīng)性。本研究著重探討弓形蟲入侵轉(zhuǎn)化過程中宿主Rac1及蟲體DNA甲基化的作用。方法:Rac1抑制劑(NSC23766)處理HFF細(xì)胞后用RH-GHP-SAG1株弓形蟲感染細(xì)胞,觀察統(tǒng)計弓形蟲入侵效率。抑制劑處理細(xì)胞后觀察宿主actin在弓形蟲感染時的重排現(xiàn)象。宿主Rac1與弓形蟲ROP2共定位現(xiàn)象觀察。COS-7細(xì)胞中過表達(dá)CFP-Rac1-WT后感染弓形蟲,在不同的時間點(diǎn)統(tǒng)計Rac1陽性PVs。Western blot檢測弓形蟲感染后不同時間點(diǎn)Rac1磷酸化水平變化。NSC23766處理細(xì)胞后觀察抑制劑對弓形蟲增殖的影響。檢測核蛋白DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性。體外克隆表達(dá)弓形蟲DNMT基因Tgdnmta和Tgdnmtb,純化重組表達(dá)的TgDNMTa和TgDNMTb并進(jìn)行DNMT活性檢測。qPCR檢測兩個基因在速、緩殖子的表達(dá)水平。弓形蟲速、緩殖子全基因組DNA甲基化高通量亞硫酸氫鹽測序。特定位點(diǎn)測序結(jié)果驗(yàn)證。差異甲基化基因的生物信息學(xué)分析。DNMT抑制劑(5-AzaC)處理弓形蟲后,觀察5-AzaC對其入侵增殖的影響。構(gòu)建弓形蟲DNMTs敲除蟲株。結(jié)果:NSC23766處理細(xì)胞后弓形蟲的入侵效率顯著低于正常組(p0.05)。正常細(xì)胞感染弓形蟲時細(xì)胞骨架重組更活躍。宿主Rac1與弓形蟲ROP2在PVM上共定位。弓形蟲一旦開始入侵便會招募Rac1向PVM聚集,隨著入侵時間的延長,Rac1會從PVM上消失。宿主細(xì)胞Rac1磷酸化水平隨著弓形蟲感染時間的增加(0-6小時)而增強(qiáng)。長期用NSC23766處理細(xì)胞會抑制弓形蟲在PV增殖(p0.05)。弓形蟲存在兩個DNMT蛋白:TgDNMTa和TgDNMTb。重組表達(dá)的TgDNMTa和TgDNMTb蛋白均具有DNMT活性,兩個基因在緩殖子轉(zhuǎn)錄水平均高于速殖子。緩殖子甲基化位點(diǎn)多于速殖子。速、緩殖子存在差異DNA甲基化的基因主要參與一些基礎(chǔ)的能量代謝過程并且和寄生蟲抵抗宿主免疫等密切相關(guān)。5-AzaC處理弓形蟲能夠抑制弓形蟲DNA甲基化的發(fā)生,進(jìn)而抑制速殖子在PV增殖(p0.05)。結(jié)論:Rac1調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞骨架重組從而有利于弓形蟲入侵。弓形蟲基因組存在DNA甲基化現(xiàn)象,且緩殖子甲基化水平高于速殖子,DNA甲基化有可能在弓形蟲速、緩殖子相互轉(zhuǎn)化過程中起作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R382.5

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本文編號：1263823