本文關(guān)鍵詞：生物傳感新方法對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞和microRNA-21的檢測(cè)研究

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【摘要】：隨著對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)研究的日益深入,大量新的研究方法、診斷標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn),這些發(fā)現(xiàn)為該疾病的早期診斷、治療和預(yù)后提供了新的理論依據(jù)和技術(shù)支持,也為該疾病逐步推廣的個(gè)體化治療帶來(lái)了希望。本研究整合了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物分析化學(xué)等技術(shù),原創(chuàng)性地發(fā)展了簡(jiǎn)單、實(shí)用的電化學(xué)傳感器分析方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的直接、快速、原位、超靈敏定量檢測(cè);并設(shè)計(jì)了基于高性能發(fā)卡堆疊循環(huán)(HSC)和邏輯門的表面等離子共振傳感器,實(shí)現(xiàn)了對(duì)CML中高表達(dá)的miRNA-21的快速、準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)。本研究主要包括以下兩個(gè)部分:1.電化學(xué)適體細(xì)胞傳感器直接快速檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞本研究整合核酸適配體相關(guān)技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)、生物素-親和素系統(tǒng)、堿性磷酸酶聯(lián)級(jí)信號(hào)放大策略以及電化學(xué)傳感檢測(cè)技術(shù),發(fā)展了一種用于慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的快速、超靈敏電化學(xué)傳感檢測(cè)新方法。核酸適體被標(biāo)記在金電極表面,適體作為新興的連接配體能夠特異的與K562細(xì)胞表面受體相結(jié)合,進(jìn)而將細(xì)胞固定在金電極表面,通過(guò)細(xì)胞表面多聚糖抗體-生物素標(biāo)記的伴刀豆蛋白A(bio-ConA)將生物素-親和素系統(tǒng)引入檢測(cè)中,繼而將親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶引入檢測(cè)系統(tǒng)作為信號(hào)識(shí)別元件,堿性磷酸酶催化底物α-NP產(chǎn)生電信號(hào),可將細(xì)胞識(shí)別事件轉(zhuǎn)化為生物酶的聯(lián)級(jí)電信號(hào)放大并用于電化學(xué)檢測(cè)。該細(xì)胞傳感器建立的基于堿性磷酸酶聯(lián)級(jí)信號(hào)放大策略檢測(cè)K562細(xì)胞時(shí),非特異性吸附較少,背景信號(hào)較低,信號(hào)放大能力明顯增加。本方法能夠?qū)?9 cells/m L的生物樣本產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào);其線性檢測(cè)范圍為102-107 cells/m L,線性范圍較寬,可達(dá)六個(gè)數(shù)量級(jí);并且適用于復(fù)雜的靜脈血樣本中K562細(xì)胞的定量檢測(cè)。本研究所提出的聯(lián)級(jí)信號(hào)放大策略有望成為檢測(cè)CML K562細(xì)胞的有力工具,也有望應(yīng)用于對(duì)其它相關(guān)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè),在細(xì)胞生物學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。2.基于高性能發(fā)卡堆疊循環(huán)和邏輯門的表面等離子共振傳感器檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病潛在標(biāo)志物Micro RNA-21研究表明miRNA-21在慢性粒細(xì)胞白血病患者細(xì)胞中有高表達(dá)。miRNA-21能夠增加CML K562細(xì)胞遷移和減少細(xì)胞凋亡,其反義寡核苷酸鏈能夠抑制CML K562細(xì)胞遷移,促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡,上調(diào)腫瘤抑制基因PDCD4的表達(dá)�？傊�,miRNA-21在CML的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,可作為該疾病潛在的檢測(cè)標(biāo)志物。本研究設(shè)計(jì)了基于高性能發(fā)卡堆疊循環(huán)(HSC)和邏輯門的表面等離子共振傳感器檢測(cè)miRNA-21。HSC是基于核酸分子雜交的動(dòng)力學(xué)控制機(jī)制的循環(huán)體系。在HSC系統(tǒng)中,設(shè)計(jì)了三個(gè)亞穩(wěn)態(tài)DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu),正常情況下這三個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)內(nèi)部有堿基互補(bǔ)配對(duì),但三者之間沒(méi)有相互反應(yīng)。當(dāng)加入靶物質(zhì)(DNA、RNA、miRNA)催化劑時(shí),短單鏈寡核苷酸與一個(gè)發(fā)卡上的立足點(diǎn)(toehold)序列相互作用,產(chǎn)生類似催化劑的作用,導(dǎo)致鏈置換級(jí)聯(lián)反應(yīng),形成分支復(fù)合物并誘導(dǎo)催化再循環(huán)。這種循環(huán)應(yīng)用于傳感器中可產(chǎn)生信號(hào)放大效應(yīng),對(duì)于增強(qiáng)傳感器靈敏度和降低基質(zhì)效應(yīng)具有重大影響。在本研究中,為了減少檢測(cè)背景,我們還引入了在發(fā)卡特定區(qū)域中取代兩個(gè)核苷酸的新策略,稱之為“環(huán)域取代”。通過(guò)這些改進(jìn),循環(huán)體系的信噪比(S/B)比最初的設(shè)計(jì)提高了6倍。最終,這種高性能循環(huán)技術(shù)成功應(yīng)用于檢測(cè)低至1.5 pM的miRNA-21。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的DNA輸入線,也可以激活“INHIBIT”、“AND”邏輯門,實(shí)現(xiàn)基于SPR平臺(tái)的信號(hào)輸出。這些研究成果不僅為HSC循環(huán)體系的開(kāi)發(fā)提供了設(shè)計(jì)指導(dǎo),而且通過(guò)檢測(cè)相關(guān)miRNA,為疾病診斷提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記和無(wú)酶的平臺(tái)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.72

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