本文關(guān)鍵詞：基于生物電紡技術(shù)的組織工程骨構(gòu)建

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【摘要】：第一部分同軸電紡P3HB4HB/GE+PVA復(fù)合支架制備及其生物相容性的研究目的:制備不同配比濃度的P3HB4HB/GE+PVA同軸電紡支架,測試其綜合性能,優(yōu)選性能優(yōu)良的組織工程支架。方法:以6%w/v P3HB4HB溶液為芯層溶液,以8%w/v的GE+PVA混合溶液為殼層溶液,每10ml殼層混合溶液中GE和PVA的質(zhì)量分別為0.6g:0.2g(A組);0.4g:0.4g(B組);0.2g:0.6g(C組)。制備同軸靜電紡絲支架,檢測5組支架支架形貌和表征、孔徑、孔隙率、接觸角、拉伸力學(xué)性能。取第4代h ASCs接種于各組支架上,CCK8檢測細(xì)胞增殖情況;細(xì)胞與支架復(fù)合后,成骨和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天,采用茜素紅、堿性磷酸酶、番紅O及阿利新藍(lán)染色驗證支架上干細(xì)胞分化潛能。結(jié)果:C組孔徑、孔隙率顯著高于A、B組(P0.01)。力學(xué)檢查,纖維支架拉伸強度、拉伸彈性模量A組B組C組,斷裂標(biāo)稱應(yīng)變A組B組C組。CCK8檢測示,第9天時C組細(xì)胞增殖率顯著高于A、B組(P0.01)。細(xì)胞支架共培養(yǎng),掃描電鏡觀察示C組支架孔徑大小較一致,相互連通,細(xì)胞在支架內(nèi)部生長良好,伸展充分,基質(zhì)分泌多;A、B組支架孔徑較小,支架表面呈串珠及蜂窩狀覆蓋物,纖維直徑大小不一,孔隙間相通性差,其中A組細(xì)胞生長較少;掃描電鏡示支架內(nèi)部C組細(xì)胞數(shù)量明顯多于A、B組。DAPI免疫熒光染色,A、B、C組見細(xì)胞附著于纖維上,C組細(xì)胞量大于A、B組,B組細(xì)胞量大于A組。經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng),成骨和成軟骨特異性染色C組均強于A、B兩組。結(jié)論:GE:PVA質(zhì)量比為2:6時,同軸電紡制備的P3HB4HB/GE+PVA纖維支架具有良好生物相容性和有一定力學(xué)強度,是一種性能優(yōu)良的組織工程支架。第二部分h ASCs復(fù)合P3HB4HB/GE+PVA納米仿生纖維體內(nèi)異位成骨能力的研究目的:探討人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合P3HB4HB/GE+PVA納米仿生纖維三維支架體外成骨誘導(dǎo)后植入裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程化骨的能力。方法:利用同軸電紡技術(shù)制作P3HB4HB/GE+PVA納米仿生三維支架,取第4代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以2×107/ml的密度接種在納米三維支架上,分誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組。掃描電鏡和投射電鏡觀察三維支架的微觀結(jié)構(gòu),吖啶橙染色和DAPI染色觀察細(xì)胞在三維支架上的生長情況。誘導(dǎo)組細(xì)胞/支架復(fù)合物在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下,未誘導(dǎo)組細(xì)胞-支架復(fù)合物在含10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下。觀察裸鼠皮下種植的細(xì)胞-支架復(fù)合物形態(tài)變化。分別于8周和16周取材行HE染色、茜素紅染色、Von Kossa染色、馬松三色染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色。結(jié)果:同軸電紡制備的納米仿生三維支架表現(xiàn)出良好的親水性和細(xì)胞吸附性。掃描電鏡見納米纖維連續(xù)、均一、光滑,細(xì)胞在纖維上粘附、生長。投射電鏡可見納米纖維的芯殼結(jié)構(gòu)。吖啶橙染色和DAPI染色均顯示細(xì)胞在支架上生長旺盛。細(xì)胞-支架復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi),裸鼠生存狀態(tài)良好,誘導(dǎo)組復(fù)合物大小形態(tài)基本保持原狀,質(zhì)地變硬;未誘導(dǎo)組逐漸縮小至完全降解。8周和16周時誘導(dǎo)組HE染色、茜素紅染色、Von Kossa染色、馬松三色染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色檢測均呈陽性。未誘導(dǎo)組均呈陰性。結(jié)論:人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合P34HB/PVA納米仿生纖維經(jīng)體外誘導(dǎo)后初步具有在裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程化骨的能力。第三部分生物電紡P3HB4HB/(GE+PVA)-h ASCs復(fù)合物體內(nèi)異位成骨能力的研究目的:利用同軸靜電紡織技術(shù),一次成型細(xì)胞-支架復(fù)合物。探討P3HB4HB/(GE+PVA)-h ASCs復(fù)合物在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化骨的能力。方法:采用同軸電紡技術(shù)制備出芯為P3HB4HB,殼為GE、PVA及h ASCs混合液的一次成型復(fù)合物,分誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組。掃描電鏡、投射電鏡、吖啶橙染色、DAPI染色觀察三維支架微觀結(jié)構(gòu)及細(xì)胞與材料的復(fù)合情況。誘導(dǎo)組細(xì)胞-支架復(fù)合體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下,未誘導(dǎo)組細(xì)胞-支架復(fù)合物體外不誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下。觀察裸鼠皮下種植的細(xì)胞/支架復(fù)合物形態(tài)變化。分別于8周和16周取材行HE染色、茜素紅染色、Von Kossa染色、馬松三色染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色、Western-blot檢測Ⅰ型膠原蛋白和骨鈣素表達(dá)。結(jié)果:掃描電鏡見細(xì)胞在纖維上粘附和生長,并分泌大量基質(zhì)。吖啶橙染色和DAPI染色均顯示細(xì)胞大量的、均勻的種植在支架。細(xì)胞-支架復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi),裸鼠生存狀態(tài)良好,誘導(dǎo)組復(fù)合物大小形態(tài)基本保持原狀,質(zhì)地變硬;未誘導(dǎo)組逐漸縮小至完全降解。8周和16周時誘導(dǎo)組HE染色、茜素紅染色、Von Kossa染色、馬松三色染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色檢測均呈陽性。未誘導(dǎo)組均呈陰性。Western-blot檢測誘導(dǎo)組植入裸鼠體內(nèi)8周部分表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白和低表達(dá)骨鈣素;16周高表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白和骨鈣素表達(dá)。未誘導(dǎo)組植入裸鼠體內(nèi)16周不表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白和骨鈣素。結(jié)論:同軸電紡一次成型構(gòu)建的P3HB4HB/(GE+PVA)-h ASCs復(fù)合物,經(jīng)體外誘導(dǎo)后初步具有在裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程化骨的能力。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08

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本文編號：1263664