本文關(guān)鍵詞：營養(yǎng)饑餓增加卵巢癌細(xì)胞對BH3模擬物凋亡敏感性及機(jī)制研究

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【摘要】：卵巢癌是臨床上最常見的婦科腫瘤,致死率較高。臨床上化療耐藥引起的抗腫瘤療效不理想,是腫瘤復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡的主要原因。卵巢癌細(xì)胞Bcl-2(B-cell lymphoma 2)家族抗凋亡蛋白等致癌基因的活化是腫瘤規(guī)避凋亡的機(jī)制之一。因此,靶向Bcl-2的小分子抑制劑的出現(xiàn)為卵巢癌臨床治療提供一個新的方向。同時,為探究Bcl-2家族在凋亡中的作用提供了工具。ABT737是模擬“BH3結(jié)構(gòu)域”的Bcl-2小分子抑制劑,但對高表達(dá)Mcl-1(myeloid cell leukemia 1)的腫瘤療效差以及副作用等限制了ABT737的殺傷作用。如何提高ABT737療效并減少副作用成為我們目前亟待解決的問題。近期人們發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝在腫瘤治療與預(yù)后過程普遍發(fā)揮重要作用。已知腫瘤代謝與細(xì)胞死亡在多種水平上緊密關(guān)聯(lián)。學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過限制營養(yǎng)等方法改變細(xì)胞代謝環(huán)境可能會增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物等抗癌劑的敏感性,還會引起B(yǎng)cl-2家族蛋白發(fā)生改變,提示Bcl-2家族與腫瘤代謝關(guān)系密切。但是營養(yǎng)與Bcl-2抗凋亡蛋白之間的關(guān)系及調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。線粒體作為主要代謝功能的細(xì)胞器在調(diào)控細(xì)胞死亡方面起到紐帶作用。而且線粒體是高度動態(tài)變化的細(xì)胞器,處于不斷的分裂與融合的動態(tài)平衡。線粒體動力學(xué)對代謝應(yīng)激特別敏感,當(dāng)營養(yǎng)饑餓時,線粒體形態(tài)常常發(fā)生適應(yīng)性改變。此外,線粒體的分裂融合還受到細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激應(yīng)答通路的嚴(yán)密調(diào)控。有研究顯示Bcl-2家族蛋白參與調(diào)控線粒體的分裂融合平衡。因此,我們推測Bcl-2家族蛋白與腫瘤代謝可能通過調(diào)控線粒體動力學(xué)決定細(xì)胞的生存與死亡。本研究采用Earle's平衡鹽溶液(EBSS)模擬營養(yǎng)饑餓,以ABT737作為抑制Bcl-2/Bcl-x L/Bcl-W的工具,通過EBSS與ABT737共同作用人卵巢癌細(xì)胞SKOV3,以葡萄糖模擬營養(yǎng)補(bǔ)充,研究腫瘤糖酵解在人卵巢癌細(xì)胞耐受營養(yǎng)饑餓中的作用,結(jié)合線粒體動力學(xué)的變化,分析營養(yǎng)饑餓影響B(tài)cl-2小分子抑制劑凋亡敏感性的機(jī)制。方法:根據(jù)實驗設(shè)計,設(shè)立對照組、實驗組,其中實驗組包括單加組與合加組,分別進(jìn)行以下實驗。(1)MTT法檢測人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生存率。倒置顯微鏡觀察SKOV3細(xì)胞形態(tài)變化。Hochest 33342染色觀察凋亡細(xì)胞核;TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡。(2)DCFH-DA染色檢測細(xì)胞ROS(reactive oxygen species)水平。JC-1染色與流式細(xì)胞術(shù)定量分析線粒體膜電勢變化。(3)檢測ATP生成變化;檢測乳酸分泌量的變化。(4)實時熒光定量PCR檢測有氧糖酵解相關(guān)基因GLUT1、LDHA、HKII表達(dá)變化。(5)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核及線粒體形態(tài)變化;免疫熒光染色與激光共聚焦聯(lián)合檢測線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1在線粒體上表達(dá)變化。(6)依據(jù)Bcl-2基因序列(Gen Bank:NM_000633),構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo/RNAi重組質(zhì)粒,命名為Si-Bcl-2,通過熒光觀察與Western blot方法進(jìn)行技術(shù)驗證。(7)提取細(xì)胞總蛋白,利用Western blot方法有氧糖酵解相關(guān)蛋白HKII、PDK1與PDHB表達(dá)變化,線粒體分裂與融合蛋白OPA1與Mfn2、Drp1與Fis1表達(dá)變化,以及Bcl-2家族蛋白表達(dá)變化。提取細(xì)胞線粒體組分蛋白,利用Western blot方法檢測線粒體分裂融合蛋白與Bcl-2家族Bak、Bax表達(dá)變化。提取細(xì)胞胞漿組分蛋白,利用Western blot方法檢測胞漿中Omi/Htr A2、細(xì)胞色素C、Cleaved-Caspase3表達(dá)變化。結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示ABT737聯(lián)合EBSS能夠有效地降低SKOV3細(xì)胞的生存率,相同濃度的ABT737或EBSS僅能有限的降低SKOV3細(xì)胞的生存率,補(bǔ)充葡萄糖減輕ABT737聯(lián)合EBSS誘導(dǎo)的生存率降低。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ABT737聯(lián)合EBSS處理組較之EBSS單加組的細(xì)胞密度降低,細(xì)胞收縮變圓。而無糖DMEM單加組與ABT737聯(lián)合無糖DMEM合加組結(jié)果顯示,細(xì)胞都有明顯收縮變圓現(xiàn)象,未見明顯差異。2.Hochest 33342染色觀察ABT737聯(lián)合EBSS處理引起SKOV3細(xì)胞核固縮、碎裂,合加補(bǔ)糖組細(xì)胞核固縮碎裂顯著減少。TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測也顯示ABT737聯(lián)合EBSS處理組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,補(bǔ)充葡萄糖后細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。3.DCFH-DA染色和JC-1染色顯示,ABT737聯(lián)合EBSS處理引起SKOV3細(xì)胞ROS積累、線粒體膜電勢下降,并誘導(dǎo)Omi/Htr A2、細(xì)胞色素C從線粒體釋放;補(bǔ)充葡萄糖后ROS生成減少和線粒體膜電勢得以恢復(fù),Omi/Htr A2、細(xì)胞色素C釋放降低。4.ABT737聯(lián)合EBSS處理能使ATP合成和乳酸分泌降低,補(bǔ)糖后會明顯增加。EBSS可以促進(jìn)糖酵解相關(guān)GLUT1、LDHA、HKII、PDK1基因或蛋白的表達(dá),抑制PDHB的蛋白表達(dá)。聯(lián)用ABT737能夠不同程度的下調(diào)GLUT1、LDHA、HKII、PDK1基因或蛋白表達(dá),上調(diào)PDHB的蛋白表達(dá)。補(bǔ)充葡萄糖后糖酵解相關(guān)基因或蛋白表達(dá)有所恢復(fù)。5.EBSS處理SKOV3細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體融合增加。聯(lián)合ABT737能夠促進(jìn)線粒體分裂,且在24 h時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核凹陷變形。補(bǔ)充葡萄糖可以重建線粒體分裂融合平衡,減輕線粒體分裂。6.ABT737與EBSS聯(lián)用發(fā)現(xiàn)融合蛋白OPA1和Mfn2表達(dá)顯著下調(diào)、分裂蛋白Drp1和Fis1表達(dá)上調(diào),而且激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ABT737聯(lián)合EBSS能夠增加Drp1移位于線粒體上,以及Fis1在線粒體上表達(dá)增多,補(bǔ)充葡萄糖后定位于線粒體上的分裂蛋白減少。7.ABT737聯(lián)合EBSS處理SKOV3細(xì)胞,能夠顯著干擾Bcl-2家族蛋白表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1表達(dá)的同時上調(diào)BH3-only蛋白Noxa與促凋亡蛋白Bax/Bak的表達(dá)。補(bǔ)充葡萄糖可以減輕對Bcl-2家族蛋白的干擾。8.RNAi Bcl-2聯(lián)合EBSS可以顯著降低人卵巢癌細(xì)胞的生存率;同時下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1表達(dá),上調(diào)BH3-only蛋白Noxa與促凋亡蛋白Bax/Bak的表達(dá)。并且下調(diào)線粒體融合蛋白OPA1和Mfn2表達(dá)、上調(diào)分裂蛋白Drp1和Fis1表達(dá)。結(jié)論:1.營養(yǎng)饑餓能夠增強(qiáng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3對BH3模擬物ABT737的凋亡敏感性。2.營養(yǎng)饑餓聯(lián)合ABT737能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的糖酵解功能,卵巢癌細(xì)胞因葡萄糖代謝功能不足而死亡。3.營養(yǎng)饑餓聯(lián)合ABT737可以促進(jìn)線粒體分裂,而且線粒體分裂可能是凋亡發(fā)生之前的上游事件。聯(lián)用ABT737能夠顯著增加線粒體損傷,破壞線粒體膜電勢,釋放促凋亡蛋白最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生。單純營養(yǎng)饑餓能夠誘導(dǎo)線粒體融合,提示線粒體融合事件可能是SKOV3細(xì)胞耐受營養(yǎng)饑餓的原因之一。4.ABT737與營養(yǎng)饑餓聯(lián)合作用SKOV3細(xì)胞后,能夠顯著干擾Bcl-2家族蛋白的表達(dá),抑制抗凋亡蛋白表達(dá),促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá),通過活化Bax/Bak誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡�；虺聊珺cl-2后能夠增強(qiáng)營養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)線粒體分裂的能力。提示Bcl-2家族蛋白可能參與調(diào)控線粒體分裂融合過程。5.葡萄糖補(bǔ)充有助于恢復(fù)ABT737聯(lián)用營養(yǎng)饑餓導(dǎo)致的糖酵解通量下降,以及線粒體分裂融合平衡的重建,進(jìn)一步證實線粒體分裂融合平衡可能由葡萄糖代謝與Bcl-2家族蛋白共同調(diào)節(jié)。綜上,糖酵解增強(qiáng)與線粒體融合可能是人卵巢癌細(xì)胞SKOV3耐受營養(yǎng)饑餓的原因,聯(lián)用ABT737通過干擾糖酵解、影響B(tài)cl-2家族與線粒體動力學(xué)變化增強(qiáng)凋亡敏感性。通過探討營養(yǎng)饑餓增加Bcl-2小分子抑制劑敏感性,分析線粒體動力學(xué)變化機(jī)制,進(jìn)一步闡明營養(yǎng)饑餓與Bcl-2家族蛋白之間交互調(diào)控機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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本文編號：1263507