本文關(guān)鍵詞：羥氯喹對酪氨酸激酶抑制劑耐藥慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的作用和機(jī)制研究

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【摘要】：第一章羥氯喹增強(qiáng)酪氨酸激酶抑制劑對T315I突變細(xì)胞的殺傷作用背景:T315I是最常見的BCR-ABL激酶區(qū)點(diǎn)突變,該突變造成BCR-ABL融合蛋白第315位蘇氨酸被異亮氨酸取代,引起融合蛋白的構(gòu)象和功能發(fā)生變化,是造成CML多藥耐藥的重要原因。帶有BCR-ABLT3151突變的CML對伊馬替尼、達(dá)沙替尼、尼羅替尼和博舒替尼等多種TKIs耐藥,第三代TKIs-博納替尼是目前治療T315I突變CML的一線藥物,另外有文獻(xiàn)報(bào)道血管表皮生長因子受體抑制劑—阿西替尼也可以在體外殺傷T315I突變的CML細(xì)胞。在藥物壓力下腫瘤細(xì)胞可以通過"自噬"來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)避免細(xì)胞凋亡,因此"自噬"是腫瘤細(xì)胞對抗藥物殺傷的利器。伊馬替尼通過抑制BCR-ABL的激酶活性在殺傷CML細(xì)胞的同時(shí)也誘導(dǎo)了 CML細(xì)胞自噬,自噬在一定程度上削弱了伊馬替尼的殺傷作用。在伊馬替尼治療的同時(shí),利用自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)抑制CML細(xì)胞自噬可以顯著增強(qiáng)伊馬替尼的抗腫瘤作用。在T315I突變CML細(xì)胞中,阿西替尼、博納替尼能否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,自噬是否為T315I突變CML細(xì)胞逃避藥物殺傷的一種機(jī)制,自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)能否增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對T315I突變CML細(xì)胞的殺傷作用目前尚無報(bào)道。目的:研究自噬抑制劑—羥氯喹(HCQ)是否能夠增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細(xì)胞的殺傷,并進(jìn)一步揭示HCQ的作用機(jī)制,為T315I突變CML的治療提供思路和方向,為推動(dòng)HCQ聯(lián)合TKIs在耐藥CML治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法:以穩(wěn)定表達(dá)BCR-ABLT3151的32D細(xì)胞(32Dp210-T315I細(xì)胞)為主要研究對象,利用Western Blot檢測LC3Ⅱ的表達(dá)、利用共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察自噬小體,分析阿西替尼、博納替尼是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。檢測HCQ能否抑制阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,并比較阿西替尼、博納替尼聯(lián)合/不聯(lián)合HCQ處理后32Dp210-T315I細(xì)胞的凋亡(流式檢測Annexin V/7AAD)、克隆形成(在半固態(tài)的甲基纖維素培養(yǎng)液中進(jìn)行7天的克隆形成實(shí)驗(yàn))、周期(細(xì)胞固定/破膜后經(jīng)PI染色,并采用流式細(xì)胞儀檢測)及細(xì)胞衰老(衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色),分析HCQ是否能夠增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細(xì)胞的殺傷作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮作用,利用shRNA敲降自噬蛋白ATG7來抑制細(xì)胞自噬,阿西替尼、博納替尼處理ATG7敲降和未敲降的32Dp210-T315I細(xì)胞后比較細(xì)胞的凋亡和周期,分析抑制自噬是否增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼在T315I突變CML治療中的作用。采用32Dp210-T315I細(xì)胞建立裸鼠皮下成瘤的模型,比較阿西替尼單藥治療和HCQ聯(lián)合阿西替尼治療對小鼠腫瘤的抑制作用。結(jié)果:阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)32Dp210-T315I細(xì)胞自噬。HCQ抑制了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,并且增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的32Dp210-T315I細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼對細(xì)胞克隆形成的抑制作用;但并不能增強(qiáng)阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的32Dp210-T315I細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老。靶向ATG7的shRNA可以有效敲降A(chǔ)TG7蛋白的表達(dá),并抑制了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的32Dp210-T315I細(xì)胞自噬。與HCQ的作用相似,ATG7蛋白敲降增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,對阿西替尼、博納替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯無影響。結(jié)論:HCQ通過抑制自噬增強(qiáng)了阿西替尼、博納替尼對32Dp210-T315I細(xì)胞的殺傷作用。第二章羥氯喹促進(jìn)NKG2D-ULBP4介導(dǎo)的Vy9Vδ2 T殺傷酪氨酸激酶抑制劑耐藥的CML細(xì)胞背景:通過靶向自噬HCQ不僅可以提高多種藥物的抗腫瘤作用,還可以有效促進(jìn)腫瘤的免疫清除,抑制低氧誘導(dǎo)的自噬可以提高肺癌細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷作用的敏感性,抑制黑色素瘤細(xì)胞自噬也可以促進(jìn)CTL殺傷黑色素瘤細(xì)胞,抑制自噬也可以增強(qiáng)IL2及某些腫瘤疫苗的治療作用。免疫治療已經(jīng)成為白血病治療的趨勢,Vγ9Vδ2T細(xì)胞是一種具有很強(qiáng)腫瘤殺傷能力的免疫細(xì)胞,甚至可以有效殺傷TKIs耐藥的CML細(xì)胞,是細(xì)胞免疫治療的"明日之星"。本部分旨在研究HCQ是否能夠促進(jìn)Vy9Vδ2T細(xì)胞殺傷TKIs耐藥的CML細(xì)胞,并揭示其作用機(jī)制。目的:探索自噬抑制劑—羥氯喹(HCQ)是否能夠增強(qiáng)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞對TKIs耐藥CML細(xì)胞的殺傷,并進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制,為推動(dòng)HCQ聯(lián)合Vγ9Vδ2 T細(xì)胞免疫治療在TKIs耐藥CML治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法:以K562/GO1細(xì)胞(人CML伊馬替尼耐藥株)和K562細(xì)胞(人CML伊馬替尼敏感株)為實(shí)驗(yàn)對象,通過Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ、P62的表達(dá)、透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量,分析HCQ對細(xì)胞的自噬抑制作用。以HCQ預(yù)處理的K562/GO1細(xì)胞和K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞,PBS預(yù)處理的K562/GO1細(xì)胞和K562細(xì)胞為對照組靶細(xì)胞;以健康志愿者外周血來源的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。將CML細(xì)胞株與Vγ9Vδ2 T細(xì)胞以不同的效靶比共培養(yǎng)進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn),比較實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞和對照組靶細(xì)胞對Vγ9Vδ2T細(xì)胞敏感性的差別。靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞以1:1的效靶比共培養(yǎng)4h后,流式細(xì)胞儀檢測Vγ9Vδ2T細(xì)胞的脫顆粒水平,分析不同靶細(xì)胞誘發(fā)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞脫顆粒的差異,并利用CML患者來源的白血病細(xì)胞作為靶細(xì)胞再次驗(yàn)證脫顆粒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。采用shRNA敲降A(chǔ)TG7蛋白抑制細(xì)胞自噬,檢測抑制自噬是否能夠增強(qiáng)CML細(xì)胞對Vy9Vδ2 T細(xì)胞殺傷作用的敏感性,并檢測HCQ是否能夠增強(qiáng)ATG7敲降的CML細(xì)胞對Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的敏感性,分析HCQ是否通過抑制自噬發(fā)揮增敏作用。流式細(xì)胞儀檢測PBS或HCQ處理對CML細(xì)胞表面NKG2DL(MICA/B、ULBP1-6)表達(dá)的影響,并利用NKG2D阻斷性抗體阻斷Vγ9Vδ2 T細(xì)胞表面NKG2D與CML細(xì)胞表面NKG2DL的相互識別,分析誘導(dǎo)ULBP4(一種NKG2DL)在CML細(xì)胞膜表達(dá)是否為HCQ增強(qiáng)CML細(xì)胞對Vy9Vδ2 T細(xì)胞敏感性的機(jī)制。通過Western Blot、熒光定量PCR、流式細(xì)胞儀檢測ULBP4的表達(dá),共聚焦免疫熒光顯微鏡檢測ULBP4在細(xì)胞內(nèi)的分布揭示HCQ促進(jìn)ULBP4表達(dá)的機(jī)制。結(jié)果:HCQ可以有效阻斷K562/GO1細(xì)胞和K562細(xì)胞自噬,并且增強(qiáng)了K562/GO1和K562細(xì)胞對Vγ9Vδ2 T殺傷作用的敏感性。但敲降A(chǔ)TG7蛋白阻斷細(xì)胞自噬并不能模擬HCQ的增敏作用,即使在ATG7敲降的K562/GO1和K562細(xì)胞中HCQ依舊可以提高Vγ9Vδ2 T對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,提示HCQ的增敏作用并不依賴于抑制腫瘤細(xì)胞自噬。HCQ誘導(dǎo)了 ULBP4在K562/GO1和K562細(xì)胞膜表達(dá),阻斷NKG2D與NKG2DL的相互識別后HCQ的增敏作用幾乎消失,提示誘導(dǎo)ULBP4在CML細(xì)胞表面表達(dá)是HCQ促進(jìn)Vy9Vδ2 T殺傷CML細(xì)胞的關(guān)鍵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HCQ并沒有提高ULBP4的轉(zhuǎn)錄及合成,而是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)潴留的ULBP4轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜。結(jié)論:HCQ誘導(dǎo)ULBP4從K562/GO1和K562細(xì)胞漿向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移,促進(jìn)了 Vy9V82 T細(xì)胞對K562/GO1和K562細(xì)胞的識別和殺傷。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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本文編號：1262779