發(fā)布時間：2017-12-07 14:12

  本文關(guān)鍵詞：缺血缺氧性腦損傷與腦缺血再灌注損傷的治療方法初步探索-p66shc基因敲除、葡萄籽原花青素

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【摘要】：腦血管病(cerebral vascular diseases,CVD)是危害人類健康及生命的三大疾病之一,而缺血性腦血管病(ischemiccerebralvasculardisease,ICD)占其中大部分。我國CVD的患病率、發(fā)病率、病死率、致殘率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢,迫切需要切實有效的治療方法預(yù)防、抑制CVD的發(fā)生和發(fā)展,降低其社會危害。缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)是指因心跳呼吸驟停、窒息、電擊、中毒等所導(dǎo)致的腦部缺血、缺氧性損害,并由此繼發(fā)的軀體、神經(jīng)、精神癥狀和體征的綜合征。對于新生兒,HIBI是威脅其生命的主要疾病之一,幸存的患兒依然可以遺留永久性神經(jīng)損傷,如腦癱等。在成人,HIBI也是威脅生命的重要疾病;可發(fā)生于窒息、心跳驟停等,也可作為心肺復(fù)蘇搶救成功后致命性的并發(fā)癥,給患者本人、家庭及整個社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和心理負擔(dān)。腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion brain injury,IRBI)也可造成腦功能嚴(yán)重受損。IRBI分為兩個階段,即腦血流中斷或血液供應(yīng)嚴(yán)重不足、血流全部或部分恢復(fù)(再灌注),這兩個階段介導(dǎo)腦組織、腦細胞的氧化應(yīng)激損傷,形成一個快速級聯(lián)反應(yīng)。上述過程包括多個環(huán)節(jié),如能量匱乏、酸中毒、興奮毒性氨基酸的合成或釋放成倍增高、鈣超載、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、凋亡啟動等。其中,氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)在IRBI機制中的核心環(huán)節(jié)目前廣泛認為HIBI和IRBI的發(fā)病機理涉及氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。嚴(yán)重的急性血管急癥或心跳驟停、窒息、點擊、中毒等,使血糖和血氧供應(yīng)嚴(yán)重不足,進而發(fā)生離子狀態(tài)的失衡、興奮毒性氨基酸的合成或釋放成倍增高、鈣超載,最終激活包括氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多條病理性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,最終的解決是神經(jīng)細胞死亡、腦損傷。因此若能通過基因干預(yù)手段或藥物手段干擾氧化應(yīng)激的病理過程,則有望改善HIBI和IRBI的預(yù)后。第一部分P66shc基因敲除對小鼠急性缺血缺氧性腦病發(fā)展的抑制作用及其機制研究研究背景p66Shc基因編碼的是磷酸化酪氨酸信號適配蛋白。p66Shc的第36位絲氨酸位點磷酸化修飾后,可通過對其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用影響氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、凋亡和血管生成。敲除p66Shc基因后,叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor,Foxp)的活性成倍增加;同時,抗氧化酶的表達及活性也相應(yīng)增高。p66shc也可通過激發(fā)AKt依賴的磷酸化修飾過程使Foxp 1及Foxp 3a失活,促進活性氧族分子的生成。因此,p66Shc是氧化應(yīng)激介導(dǎo)細胞凋亡的過程中及其重要的因子。研究目的研究p66shc基因敲除是否可以抑制小鼠缺血缺氧性腦損傷的病程;探究p66shc基因敲除在干預(yù)小鼠缺血缺氧性腦損傷病程中對氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血管生成、凋亡、抗氧化酶表達等的作用。研究方法首先提取鼠尾基因組DNA,用Southern雜交的方法進行基因鑒定;小鼠分為四組,設(shè)置對照、雙盲、隨機;制作小鼠缺血缺氧性腦損傷的模型,對血流動力學(xué)(局部腦血流量、收縮壓、舒張壓)和血生化進行檢測;在造模后24小時,行顱腦核磁共振(magneticresonanceimaging,MRI)檢查,計算并比較各組小鼠缺血缺氧性腦損傷灶的體積;利用改良神經(jīng)功能評分(modified neurological severity score,mNSS)系統(tǒng),測定并分析比較各組小鼠在造模后1小時、24小時、3天、7天的神經(jīng)功能;在造模后24小時斷頭取腦切片,行免疫組化檢查,分析比較腦損傷灶及周圍區(qū)域NeuN、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CD34、Bax和Bcl-2陽性細胞或組織的表達,行TUNEL熒光染色進一步評估凋亡程度;用Western Blot方法檢測并比較個組小鼠在造模24小時后損傷側(cè)腦組織勻漿中NADPH氧化酶亞基gp91Phox(作為p66shc的下游調(diào)控靶標(biāo))的表達;檢測各組小鼠在造模24小時后血液中超氧陰離子自由基(superoxide anion free radical,SAFR)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)的表達水平,以此反映小鼠整體的、系統(tǒng)的氧化應(yīng)激程度;測定各組小鼠在造模24小時后損傷側(cè)腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)的表達,以此分析p66shc基因敲除對抗氧化酶活力的促進作用。研究結(jié)果MRI結(jié)果顯示p66shc基因敲除組小鼠缺血缺氧性腦損傷灶體積明顯小于對照組(野生型,wild type)。p66shc基因敲除組小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)好于對照組(野生型,wild type);p66shc基因敲除組小鼠的mNSS評分低于對照組(野生型,wild type),且自行恢復(fù)的能力高于對照組(野生型,wild type),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(由ΔmNSS評估)。p66shc基因敲除組小鼠缺血缺氧性腦損傷灶及其周邊區(qū)的神經(jīng)元存活數(shù)目(由NeuN反映)明顯多于對照組(野生型,wild type),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。p66shc基因敲除組小鼠缺血缺氧性腦損傷灶及其周邊區(qū)的氧化應(yīng)激程度(由8-OhdG反映)和炎性反應(yīng)程度(由TNF-α反映)明顯強于對照組(野生型,wild type),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。p66shc基因敲除能改善缺血缺氧性腦損傷小鼠的凋亡平衡;促進Bcl-2的表達,抑制Bax的表達,抑制神經(jīng)元的凋亡進程。p66shc基因敲除對小鼠腦組織中NADPH氧化酶(gp91phox)具有抑制作用。p66shc基因敲除抑制小鼠缺血缺氧性腦損傷介導(dǎo)的機體系統(tǒng)氧化應(yīng)激(p66shc基因敲除組小鼠血液中的MDA和超氧陰離子自由基均低于對照組)。腦缺血再灌注損傷24小時后,p66shc基因敲除組小鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力高于對照組(野生型,wild type),具有更強的抗氧化應(yīng)激能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,也可能是其主要機制之一。研究結(jié)論p66shc基因敲除可以抑制小鼠缺血缺氧性腦損傷的病程,保護神經(jīng)功能,減少梗死灶體積。其機制可能是p66shc基因敲除抑制了小鼠缺血缺氧性腦損傷病程中局部腦組織和系統(tǒng)的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、凋亡,未明顯抑制局部微血管生成,提高了抗氧化酶的表達和活力。第二部分葡萄籽原花青素提取物對小鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用及其機制研究研究背景葡萄籽原花青素提取物(grapeseed procyanidin extract,GSPE)是由黃烷醇衍生而來的多酚類化合物,在葡萄、藍莓等許多種植物中大量存在;在生物化學(xué)上,GSPE是由表兒茶素、兒茶素經(jīng)過縮合反應(yīng)而來。研究發(fā)現(xiàn),GSPE具有廣泛的生物活性,如抗氧化活性、調(diào)節(jié)和改善免疫反應(yīng)作用、抑制癌細胞的作用、抗氧化應(yīng)激活性等。GSPE中含有大量的富電子羥基基團,具有非常強大的抗氧化應(yīng)激、抗炎性反應(yīng)、清理自由基等的作用,是目前發(fā)現(xiàn)的最強效的脂質(zhì)過氧化抑制劑和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的清除劑之一。研究目的研究GSPE是否可以抑制小鼠腦缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion brain damage,IRBI)的病程;探究GSPE在干預(yù)小鼠IRBI病程中對氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血管生成、凋亡、抗氧化酶表達等的作用。研究方法小鼠分為四組,設(shè)置對照、雙盲、隨機;在制作小鼠IRBI模型24小時后,行顱腦核磁共振(MRI)檢查,計算并比較各組小鼠IRBI損傷灶的體積;利用神經(jīng)損害評分(mNSS)系統(tǒng),測定并分析比較各組小鼠在造模后1小時、24小時、3天、7天的神經(jīng)功能;在造模后24小時斷頭取腦切片,行免疫組化檢查,分析比較腦損傷灶及周圍區(qū)域NeuN、CD34、Bax和Bcl-2陽性細胞或組織的表達;用專用試劑盒測定各組小鼠在造模24小時后損傷側(cè)腦組織勻漿中谷胱甘肽過氧化物酶[glutathione peroxidation(GSH-Px)]的表達,以此分析GSPE對抗氧化酶活力的促進作用。研究結(jié)果MRI結(jié)果顯示GSPE組小鼠IRBI損傷灶體積明顯小于對照組(生理鹽水組)。GSPE組小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)好于對照組(生理鹽水組);GSPE組小鼠的mNSS評分低于對照組(生理鹽水組)。GSPE組小鼠IRBI損傷灶及其周邊區(qū)的神經(jīng)元存活數(shù)目(由NeuN反映)及微血管密度(由CD34反映)明顯多于對照組(生理鹽水組),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。GSPE能改善IRBI小鼠的凋亡平衡;促進Bcl-2的合成,抑制Bax的合成,抑制神經(jīng)元的凋亡進程。小鼠腦缺血再灌注損傷24小時后,GSPE組小鼠腦組織中GSH-Px活力高于對照組(生理鹽水組),具有更強的抗氧化應(yīng)激能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,也可能是其主要機制之一。研究結(jié)論GSPE可以抑制小鼠IRBI的病程,保護神經(jīng)功能,減少梗死灶體積。其機制可能是GSPE抑制了小鼠IRBI病程中局部腦組織和系統(tǒng)的氧化應(yīng)激、凋亡,促進了局部微血管生成,提高了抗氧化酶的表達和活力。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743

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