發(fā)布時間：2017-12-07 04:33

  本文關(guān)鍵詞：沉默miR-769表達對抑制黑色素瘤細胞增殖的實驗研究

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【摘要】：目的確定黑色素瘤中miR-769表達是否異常并篩選其靶基因,研究其具體發(fā)病機制及驗證沉默miR-769能否抑制黑色素瘤細胞增殖。方法1、實驗對象與分組①黑色素瘤患者的病理標本,按病理分期命名為原位組(10例)和轉(zhuǎn)移組(14例);24例正常色素痣病理標本命名為色素痣組。7種黑色素瘤細胞株命名為MM組,人表皮黑色素細胞系命名為PEM組。②黑色素瘤A375細胞株命名為A375組;黑色素瘤細胞株A375分三組分別轉(zhuǎn)染 miR-769 mimics、miR-769-inhibitor 和隨機 RNA 序列,命名為 mimics 組,inhibitor 組和 NC 組。③GSK3β野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A375細胞株,命名為WT組和MUT 組。④inhibitor 組分別再轉(zhuǎn)染干擾 RNA GSK3β-siRNA#1 和 GSK3β-siRNA#2,命名為RNA干擾組。2、病理標本和黑色素瘤細胞中miR-769表達黑色素瘤(原位組、轉(zhuǎn)移組)與色素痣組的病理標本;PEM組與MM組細胞株分別進行QRT-PCR試驗,測定miR-769表達量并對比。3.miR-769作用機制研究Western Blot檢測MM組、inhibitor組和PEM組細胞中GSK3β的表達量;雙熒光素酶試驗測定mimics組、inhibitor組、MUT組熒光素酶的活性;Western Blot檢測inhibitor組和NC組的cyclin D1和c-myc的表達量。4、沉默miR-769研究mimics組,inhibitor組和NC組分別進行QRT-PCR實驗、MTT試驗、平板細胞克隆實驗和BrdU細胞增殖實驗。RNA干擾組分別進行Western Blot實驗、平板細胞克隆形成實驗、錨定非依賴生長分析實驗、BrdU細胞增殖實驗。5.統(tǒng)計分析采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件,對數(shù)據(jù)進行方差分析、t檢驗、卡方檢驗。以P0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.QRT-PCR 檢測 miR-769 表達黑色素瘤病理標本轉(zhuǎn)移組中miR-769的平均表達水平最高,其次是原位組,色素痣組最低;MM組中miR-769的平均表達水平較PEM組高。2.miR-769作用機制Western Blot:inhibitor組GSK3β的表達量最高,其次是NC組,A375組幾乎沒有。雙熒光素酶報告:mimics組的細胞熒光素酶活性降低,inhibitor組升高,MUT組的不變。Western Blot:A375組中cyclin D1和c-myc表達明顯提高;inhibitor組表達下降。3.沉默 miR-769QRT-PCR:mimics組miR-769表達最高,其次是NC組,inhibitor組最低;MTT試驗:mimics組OD值最高,NC組其次,inhibitor組最低;平板細胞克隆實驗中mimics組細胞克隆形成率最高,NC組其次,inhibitor組最低;BrdU細胞增殖實驗中mimics組S期細胞比例最高,NC組其次,inhibitor組最低。Western Blot:RNA干擾組GSK3β的蛋白條帶幾乎沒有;平板細胞克隆結(jié)果:RNA干擾組中細胞克隆形成率顯著升高;錨定非依賴生長分析實驗:RNA干擾組中直徑大于0.1mm集落數(shù)目顯著高于NC組;BrdU細胞增殖實驗:RNA干擾組中S期細胞比例明顯高于NC組。結(jié)論:1、miR-769過表達與黑色素瘤發(fā)病密切相關(guān)。2.黑色素瘤細胞中miR-769下調(diào)靶向基因GSK3β表達,激活cyclin D1和c-myc,從而促進黑色素瘤細胞的增殖。3.沉默miR-769表達可上調(diào)GSK3β表達,進而抑制黑色素瘤細胞的增殖。小干擾RNA可下調(diào)GSK3β的表達,抑制這一過程。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5

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4 實習生 易立;黑色素瘤,是否無藥可治？[N];科技日報;2011年

5 記者 張e，

本文編號：1261187