本文關(guān)鍵詞：沉默miR-769表達(dá)對(duì)抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的確定黑色素瘤中miR-769表達(dá)是否異常并篩選其靶基因,研究其具體發(fā)病機(jī)制及驗(yàn)證沉默miR-769能否抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖。方法1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組①黑色素瘤患者的病理標(biāo)本,按病理分期命名為原位組(10例)和轉(zhuǎn)移組(14例);24例正常色素痣病理標(biāo)本命名為色素痣組。7種黑色素瘤細(xì)胞株命名為MM組,人表皮黑色素細(xì)胞系命名為PEM組。②黑色素瘤A375細(xì)胞株命名為A375組;黑色素瘤細(xì)胞株A375分三組分別轉(zhuǎn)染 miR-769 mimics、miR-769-inhibitor 和隨機(jī) RNA 序列,命名為 mimics 組,inhibitor 組和 NC 組。③GSK3β野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株,命名為WT組和MUT 組。④inhibitor 組分別再轉(zhuǎn)染干擾 RNA GSK3β-siRNA#1 和 GSK3β-siRNA#2,命名為RNA干擾組。2、病理標(biāo)本和黑色素瘤細(xì)胞中miR-769表達(dá)黑色素瘤(原位組、轉(zhuǎn)移組)與色素痣組的病理標(biāo)本;PEM組與MM組細(xì)胞株分別進(jìn)行QRT-PCR試驗(yàn),測(cè)定miR-769表達(dá)量并對(duì)比。3.miR-769作用機(jī)制研究Western Blot檢測(cè)MM組、inhibitor組和PEM組細(xì)胞中GSK3β的表達(dá)量;雙熒光素酶試驗(yàn)測(cè)定mimics組、inhibitor組、MUT組熒光素酶的活性;Western Blot檢測(cè)inhibitor組和NC組的cyclin D1和c-myc的表達(dá)量。4、沉默miR-769研究mimics組,inhibitor組和NC組分別進(jìn)行QRT-PCR實(shí)驗(yàn)、MTT試驗(yàn)、平板細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)和BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。RNA干擾組分別進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)、平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、錨定非依賴生長(zhǎng)分析實(shí)驗(yàn)、BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。5.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)。以P0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.QRT-PCR 檢測(cè) miR-769 表達(dá)黑色素瘤病理標(biāo)本轉(zhuǎn)移組中miR-769的平均表達(dá)水平最高,其次是原位組,色素痣組最低;MM組中miR-769的平均表達(dá)水平較PEM組高。2.miR-769作用機(jī)制Western Blot:inhibitor組GSK3β的表達(dá)量最高,其次是NC組,A375組幾乎沒(méi)有。雙熒光素酶報(bào)告:mimics組的細(xì)胞熒光素酶活性降低,inhibitor組升高,MUT組的不變。Western Blot:A375組中cyclin D1和c-myc表達(dá)明顯提高;inhibitor組表達(dá)下降。3.沉默 miR-769QRT-PCR:mimics組miR-769表達(dá)最高,其次是NC組,inhibitor組最低;MTT試驗(yàn):mimics組OD值最高,NC組其次,inhibitor組最低;平板細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)中mimics組細(xì)胞克隆形成率最高,NC組其次,inhibitor組最低;BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中mimics組S期細(xì)胞比例最高,NC組其次,inhibitor組最低。Western Blot:RNA干擾組GSK3β的蛋白條帶幾乎沒(méi)有;平板細(xì)胞克隆結(jié)果:RNA干擾組中細(xì)胞克隆形成率顯著升高;錨定非依賴生長(zhǎng)分析實(shí)驗(yàn):RNA干擾組中直徑大于0.1mm集落數(shù)目顯著高于NC組;BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):RNA干擾組中S期細(xì)胞比例明顯高于NC組。結(jié)論:1、miR-769過(guò)表達(dá)與黑色素瘤發(fā)病密切相關(guān)。2.黑色素瘤細(xì)胞中miR-769下調(diào)靶向基因GSK3β表達(dá),激活cyclin D1和c-myc,從而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。3.沉默miR-769表達(dá)可上調(diào)GSK3β表達(dá),進(jìn)而抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。小干擾RNA可下調(diào)GSK3β的表達(dá),抑制這一過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.5

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5 記者 張e，

本文編號(hào)：1261187