本文關(guān)鍵詞：凋亡相關(guān)蛋白BCL-B在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中對肝星狀細胞凋亡的調(diào)節(jié)及機制研究

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【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種病因引起的慢性肝病反復(fù)損傷導(dǎo)致的以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積為特征的病理生理過程,嚴重者會轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌,預(yù)后不良,死亡率高。靜態(tài)的HSCs富含維生素A,肝臟受到外來刺激時,細胞內(nèi)維生素A脂滴消失,HSCs轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài),增殖、遷移能力增強,產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì),該過程是肝纖維化發(fā)生的“中心環(huán)節(jié)”。有研究表明,去除致病因素后肝纖維化能夠發(fā)生逆轉(zhuǎn)。肝纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵是減少膠原分泌,增加其降解。有研究證實活化的HSCs是膠原纖維的主要來源,兩項嚙齒類動物研究表明,大約50%活化的肝星狀細胞在纖維化逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)生凋亡,而其余的則恢復(fù)到靜止表型。因此,以活化的HSCs作為靶點進行干預(yù),誘導(dǎo)其凋亡、抑制其增殖及膠原分泌,可逆轉(zhuǎn)肝纖維化。目前,對于治療肝纖維化尚缺乏有效方法。因此,研究活化的HSC的凋亡機制,對于逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有重要意義。細胞凋亡分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡,內(nèi)源性凋亡又稱為線粒體途徑凋亡,其核心事件是線粒體外膜通透性增加(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)。MOMP主要是由活化的BH3-only蛋白誘發(fā),該類蛋白可誘導(dǎo)Bcl-2(B cell lymphoma-2)家族兩個促凋亡分子BAX(Bcl-2-associated X protein)和/或BAK(Bcl-2 antagonist or killer)在線粒體外膜形成寡聚體,進而形成超分子通道介導(dǎo)線粒體膜間隙的蛋白釋放,如細胞色素c(cytochrome c,cyt c),進而觸發(fā)內(nèi)源性細胞凋亡。因此,線粒體穩(wěn)態(tài)在細胞凋亡中起重要作用。肝臟是一個高能耗器官,線粒體在能量生成過程中會產(chǎn)生大量的超氧陰離子,這些活性氧成分會損傷線粒體內(nèi)蛋白、脂類及核酸,而功能蛋白的損傷會增加活性氧的產(chǎn)生、加劇線粒體損傷。當?shù)鞍准癉NA損傷累積到一定程度,超過其自身修復(fù)能力時,細胞會通過自噬方式對損傷線粒體進行選擇性地清除,被稱為線粒體自噬(mitophagy)。目前的觀點認為,線粒體自噬性清除與細胞凋亡同時存在,但是目前并無文獻明確地證明線粒體清除與凋亡的相互關(guān)系。hsc中的線粒體清除及其與肝纖維化的關(guān)系尚無報道。目前認為bcl-2家族蛋白同時參與了線粒體自噬性清除及細胞凋亡過程,該家族包括6個抗凋亡蛋白(bcl-2、bcl-b、bcl-w、bcl-xl、bfl-1和mcl-1)、許多促凋亡的bh3-only蛋白及其輔因子bax和bak。bcl-2家族蛋白定位于線粒體外膜,通過控制bax/bak寡聚體通道的聚合形成,從而調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性,啟動內(nèi)源性細胞凋亡。該家族蛋白還可通過結(jié)合于自噬調(diào)節(jié)因子beclin-1阻斷自噬小體的形成,bcl-2/beclin1相互作用是細胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點。bcl-b(又稱為bcl2l10)是最晚發(fā)現(xiàn)且研究最少的一個bcl-2家族抗凋亡蛋白,具有其典型結(jié)構(gòu)特征。bcl-b在人體組織中廣泛表達,而在hek293t細胞中,可通過與bax結(jié)合而抑制凋亡。目前bcl-b在線粒體清除中的作用尚不清楚,并且bcl-b在肝纖維化形成、逆轉(zhuǎn)及hsc凋亡中的表達情況及其功能,未見報道。本課題旨在觀察hsc凋亡及肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中凋亡相關(guān)蛋白bcl-b表達及線粒體含量的變化情況,闡明bcl-b對hsc凋亡的調(diào)控作用及其可能的分子機制。本學位論文由以下三部分組成:第一部分:肝纖維化逆轉(zhuǎn)小鼠模型中原代hsc線粒體含量減少及bcl-b表達下調(diào)目的:建立纖維化逆轉(zhuǎn)小鼠模型,觀察在纖維化逆轉(zhuǎn)過程中原代hsc的bcl-b表達及線粒體含量變化。方法:應(yīng)用四氯化碳(carbontetrachloride,ccl4)腹腔注射法誘導(dǎo)小鼠肝纖維化,停藥后自發(fā)逆轉(zhuǎn),建立肝纖維化逆轉(zhuǎn)模型。肝組織石蠟切片經(jīng)he與masson染色檢測肝臟病理變化。賴氏法檢測血清alt、ast的含量。免疫組織化學法(immunohistochemistry,ihc)和westernblot檢測collageni和α-sma的表達。采用原位灌流、梯度密度離心技術(shù)分離小鼠原代hscs,經(jīng)光鏡及熒光顯微鏡鑒定。westernblot檢測線粒體蛋白tom20的變化,picogreen檢測細胞中線粒體dna總量,評價線粒體清除情況。tunel和流式細胞術(shù)(flowcytometry,fcm)檢測細胞凋亡。westernblot檢測bcl-b表達情況。結(jié)果:1成功復(fù)制肝纖維化逆轉(zhuǎn)小鼠模型采用ccl4腹腔注射法誘導(dǎo)可逆性的肝纖維化,停止注射后,肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn),以此模擬肝纖維化逆轉(zhuǎn)。實驗分為5組:對照組(oil)、纖維化組(6w)、恢復(fù)1周組(r1w)、恢復(fù)2周組(r2w)、恢復(fù)4周組(r4w)。oil組小鼠肝臟質(zhì)地柔軟,表面光滑,色澤鮮艷。ccl4給藥6w組小鼠肝臟體積稍縮小,質(zhì)硬,黃褐色,表面細顆粒樣,隨停藥時間延長肝臟表面逐漸恢復(fù)光滑柔軟。he及masson染色結(jié)果顯示,oil組小鼠肝板排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,膠原纖維極少或缺如。6w組小鼠肝臟有出血、壞死,肝細胞空泡、脂肪變性,大量炎細胞浸潤,肝板正常排列消失,小葉結(jié)構(gòu)紊亂,膠原纖維組織明顯增生沉積。隨著停藥時間延長,r1w、r2w、r4w組小鼠肝臟壞死逐漸得到改善,肝板排列逐漸恢復(fù),肝細胞脂肪變性減少,膠原纖維組織減少。免疫組織化學結(jié)果表明,α-sma和collageni在6w組肝組織中陽性細胞數(shù)增多、染色加深,明顯高于oil組,r1w組的表達較6w組無明顯變化,隨停藥時間延長,r4w組的表達明顯減少。westernblot結(jié)果顯示,與oil組相比,6w組兩種蛋白表達升高,隨停藥時間延長,兩種蛋白的表達逐漸降低,在r4w組表達最低。ccl4腹腔注射6w時alt、ast水平較oil組明顯升高,停藥后轉(zhuǎn)氨酶水平逐漸下降。以上結(jié)果表明肝纖維化逆轉(zhuǎn)模型復(fù)制成功。2成功提取小鼠原代hscs應(yīng)用鏈酶及Ⅳ型膠原酶原位灌注后,進行梯度密度離心,分離小鼠原代hscs。在波長328nm的倒置熒光顯微鏡下觀察,細胞可自發(fā)藍綠色熒光。顯微鏡下,剛分離的hscs未活化,呈圓形或橢圓形,體積較大,折光性強。經(jīng)光鏡及熒光顯微鏡鑒定,所提細胞純度約為80%,得率約為1×105~1.5×105/小鼠。接種于塑料培養(yǎng)瓶24h后,細胞全部貼壁,本研究取培養(yǎng)3天的原代hsc用于實驗,此時細胞仍為靜止狀態(tài),未被活化;較接近于在體狀態(tài)。3肝纖維化逆轉(zhuǎn)中原代hscs凋亡增加tunel染色結(jié)果顯示,oil對照組中hscs的凋亡較明顯,6w組中hscs凋亡明顯減低,只有極少部分處于凋亡狀態(tài)。肝纖維化逆轉(zhuǎn)階段,hscs的凋亡均明顯增多,但與停藥時間無明顯相關(guān)性。應(yīng)用annexin-v/pi雙重染色,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示,與oil組相比,6w組hscs凋亡顯著減少,在停藥后細胞凋亡增加,于停藥2周時細胞凋亡最為明顯,以早期凋亡為主,而在停藥4周時表現(xiàn)為晚期凋亡為主,細胞總凋亡率與停藥時間無明顯相關(guān)性。表明在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中,hscs凋亡增加。4肝纖維化逆轉(zhuǎn)中hscs線粒體含量減少,bcl-b表達下調(diào)從原代hscs中提取蛋白,應(yīng)用westernblot方法檢測線粒體膜蛋白tom20的表達變化。結(jié)果顯示,在6w肝纖維化組中,tom20較oil對照組明顯升高。隨停藥時間延長,tom20的表達逐漸降低,在r4w表達最低,但仍高于oil組水平。表明在肝纖維化時,hscs線粒體含量豐富;而在纖維化逆轉(zhuǎn)過程中,hscs線粒體清除增強,細胞內(nèi)線粒體含量逐步減少。picogreen熒光染色觀察原代hscs中線粒體dna(mtdna)含量。結(jié)果顯示,在6w組的hscs中,胞漿中熒光亮度較oil組明顯增強,且聚集形成團塊狀,面積較大,表明線粒體增多、融合。而在停藥后的r1w組的細胞中,熒光強度明顯減弱,且熒光團塊明顯減小。r2w組較r1w組無明顯變化,r4w組中熒光強度雖較前無明顯變化,但熒光團塊消失,胞漿中熒光較均勻一致。表明在纖維化形成時,hscs中線粒體數(shù)量增加且融合聚集;在肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中,線粒體逐漸分散在胞漿中,且數(shù)量減少。westernblot結(jié)果顯示,oil組中bcl-b表達較低,6w組中的表達明顯升高,隨停藥時間延長、肝纖維化逆轉(zhuǎn),該蛋白的表達逐漸下降,在r4w組中表達接近oil組。表明bcl-b表達與原代hscs的凋亡存在相關(guān)性。結(jié)論:肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中hscs的凋亡及線粒體清除增加,bcl-b表達下調(diào)。第二部分:bcl-b對肝星狀細胞凋亡及線粒體清除的影響目的:誘導(dǎo)hsc細胞株lx2凋亡,驗證肝纖維化逆轉(zhuǎn)小鼠模型中原代hscs的結(jié)果。抑制線粒體清除,明確線粒體清除對hscs凋亡的影響。在lx2中敲低及過表達bcl-b,觀察其對lx2凋亡及線粒體清除的影響。方法:應(yīng)用凋亡誘導(dǎo)劑gtx建立lx2凋亡模型,應(yīng)用抑制劑csa干預(yù)細胞抑制線粒體清除,設(shè)計并合成可敲低bcl-b表達的sirna及過表達bcl-b的腺病毒,在lx2中敲低及過表達bcl-b。用westernblot檢測bcl-b、線粒體蛋白、凋亡相關(guān)蛋白及hsc活化相關(guān)蛋白的表達;picogreen檢測線粒體dna含量;tunel檢測細胞凋亡,反映細胞凋亡、線粒體清除及bcl-b表達水平。結(jié)果:1在hsc細胞株中誘導(dǎo)凋亡,線粒體清除增強,bcl-b表達下調(diào)應(yīng)用膠霉毒素(gliotoxin,gtx)誘導(dǎo)hsc細胞株lx2凋亡,在細胞水平模擬肝纖維化逆轉(zhuǎn)。(1)tunel染色檢測hscs凋亡率,結(jié)果顯示,gtx組細胞凋亡率較對照組顯著升高。westernblot結(jié)果顯示,與對照組相比,gtx組活化的凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和活化的內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase9顯著升高。同時,gtx組的hsc活化相關(guān)蛋白collageni和α-sma的表達明顯減少。表明gtx成功誘導(dǎo)了hscs凋亡。(2)并且gtx組的線粒體蛋白tom20較對照組顯著降低。picogreen熒光染色法檢測mtdna含量,對照組胞漿中綠色熒光強度較高、呈顆粒狀,誘導(dǎo)凋亡后,熒光明顯減弱且散在分布。說明在凋亡細胞中線粒體總量減少且分散,表明在凋亡的lx2中,線粒體清除明顯增強。(3)westernblot結(jié)果顯示,gtx誘導(dǎo)lx2凋亡后,bcl-b的蛋白表達水平較對照組明顯降低。2抑制線粒體清除可抑制hscs凋亡,上調(diào)bcl-b表達(1)westernblot結(jié)果顯示,用線粒體自噬抑制劑環(huán)孢菌素a(csa)處理細胞后,線粒體膜蛋白tom20表達升高。picogreen染色結(jié)果顯示,加入csa后細胞中綠色點狀熒光的數(shù)量增加,強度升高。表明csa成功抑制了線粒體的清除。(2)tunel染色檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,csa干預(yù)后,細胞凋亡率降低。westernblot結(jié)果顯示,與對照組相比,csa刺激后,活化的凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase9及cleaved-caspase3降低。并且hsc活化指標collageni和α-sma的表達顯著升高。表明抑制線粒體清除后lx2凋亡減少。(3)westernblot結(jié)果顯示,csa抑制線粒體清除后,bcl-b升高。3敲低bcl-b促進hscs凋亡及線粒體清除在lx2轉(zhuǎn)染bcl-b特異性的sirna(sibcl-b),并轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的sirna(sicon)作為對照組,收集蛋白檢測bcl-b表達。(1)westernblot結(jié)果顯示,sibcl-b組較sicon組bcl-b蛋白表達減少了79%,說明bcl-b被成功敲低了。(2)用tunel染色檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示sibcl-b組的細胞凋亡率較sicon組明顯升高。westernblot結(jié)果顯示,敲低bcl-b后,與sicon組相比,cleaved-caspase9及cleaved-caspase3蛋白水平升高。同時,collagen和α-sma表達明顯下調(diào)。說明敲低bcl-b會導(dǎo)致lx2凋亡增加及分泌功能降低。(3)westernblot檢測線粒體蛋白tom20結(jié)果顯示,sibcl-b組中tom20蛋白表達較sicon組顯著降低。picogreen結(jié)果顯示,sibcl-b組細胞中的熒光強度及面積均較sicon組降低,說明mtdna減少。表明敲低bcl-b后,lx2中線粒體數(shù)量減少,線粒體清除增加。4過表達bcl-b可抑制lx2凋亡及線粒體清除通過感染腺病毒載體在lx2中過表達bcl-b(adbcl-b),對照組感染空載體腺病毒(adcon)。感染效率可達90%以上。(1)應(yīng)用westernblot檢測bcl-b蛋白表達,結(jié)果顯示adbcl-b組較adcon組升高約4.7倍,說明bcl-b被成功過表達。(2)tunel染色檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示,與adcon組相比,adbcl-b組細胞凋亡率明顯降低。westernblot結(jié)果顯示,較adcon組,adbcl-b組cleaved-caspase9和cleaved-caspase3顯著降低。同時,adbcl-b組的collageni和α-sma表達增加。說明過表達bcl-b能抑制lx2凋亡,并促進其活化。(3)對線粒體蛋白tom20的表達進行檢測,結(jié)果表明,與adcon組相比,adbcl-b組tom20的表達升高。表明過表達bcl-b的細胞中線粒體含量增加,線粒體清除被抑制。結(jié)論:抑制線粒體清除導(dǎo)致細胞凋亡減少。bcl-b可抑制lx2凋亡及線粒體清除。第三部分:bcl-b通過抑制細胞線粒體清除抑制hsc凋亡目的:明確bcl-b是否通過抑制線粒體清除調(diào)節(jié)細胞凋亡。探討bcl-b抑制線粒體清除的分子機制。方法:在敲低bcl-b的lx2細胞中應(yīng)用線粒體自噬抑制劑,通過westernblot檢測線粒體蛋白表達及picogreen檢測mtdna驗證線粒體清除被抑制,應(yīng)用westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達;tunel法檢測細胞凋亡率。敲低或過表達bcl-b,檢測細胞中p-parkin的表達變化。應(yīng)用免疫共沉淀和免疫熒光雙染的方法檢測lx2細胞中bcl-b與p-parkin是否存在相互結(jié)合。結(jié)果:1抑制線粒體清除可抑制bcl-b敲低對lx2的作用為明確bcl-b是否通過抑制線粒體清除來抑制細胞凋亡,在敲低bcl-b的細胞中阻斷線粒體清除過程。(1)檢測線粒體蛋白表達情況,結(jié)果顯示,sibcl-b+csa組的線粒體膜蛋白tom20表達量較sibcl-b組明顯升高。picogreen檢測mtdna結(jié)果顯示,csa干預(yù)后較單純sibcl-b轉(zhuǎn)染組的熒光強度明顯增強,熒光顆粒更聚集。說明csa成功抑制了線粒體清除。(2)tunel法檢測細胞凋亡情況,結(jié)果顯示,sibcl-b+csa組較sibcl-b組細胞凋亡率明顯降低。與sibcl-b組相比,sibcl-b+csa組的cleased-caspase3和cleased-caspase9水平明顯降低;而collageni和α-sma的蛋白表達量升高。表明抑制線粒體清除可抑制bcl-b敲低誘導(dǎo)的lx2凋亡。2bcl-b下調(diào)p-parkin水平parkin的磷酸化活化是啟動線粒體自噬的關(guān)鍵。westernblot結(jié)果顯示,敲低bcl-b使p-parkin的水平升高,而過表達bcl-b時,p-parkin水平明顯降低。表明bcl-b可抑制線粒體自噬關(guān)鍵蛋白parkin的磷酸化活化。3bcl-b與p-parkin存在相互作用(1)免疫共沉淀結(jié)果顯示,以兔抗p-parkin(鼠抗bcl-b)對lx2總蛋白進行交互沉淀,并用兔抗igg(鼠抗igg)沉淀作為對照,在igg沉淀組未檢測到條帶,在p-parkin及bcl-b沉淀組分別檢測到bcl-b和p-parkin的條帶,說明bcl-b和p-parkin存在相互結(jié)合。(2)用紅色熒光標記bcl-b,用綠色熒光標記p-parkin,用帶藍色熒光的dapi標記細胞核,進行免疫細胞熒光染色。結(jié)果顯示,在lx2中,綠色熒光標記的p-parkin分布于細胞質(zhì),核周區(qū)域較為集中,紅色熒光標記的bcl-b在胞漿中呈斑點狀分布,兩者熒光部分重疊(黃色區(qū)域),表明bcl-b與p-parkin存在部分共定位。結(jié)論:BCL-B可通過抑制線粒體清除抑制HSC凋亡。在HSC中,BCL-B和p-Parkin蛋白存在相互作用,BCL-B可能通過與p-Parkin結(jié)合,抑制其磷酸化活化,從而抑制線粒體自噬性清除。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

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6 孫偉華;預(yù)先低劑量X線照射對荷HepG2裸鼠P53等蛋白表達的影響[D];青島大學;2012年

7 李均;小鼠胚胎消化管上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達[D];重慶醫(yī)科大學;2003年

8 張利平;TOCP誘發(fā)母雞OPIDN發(fā)生過程中神經(jīng)電生理、抗氧化系統(tǒng)及凋亡相關(guān)蛋白變化[D];山東大學;2006年

9 韓金利;黃芪對大鼠腦出血灶周圍凋亡細胞形態(tài)與凋亡相關(guān)蛋白及其基因作用的研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2013年

10 張勤麗;鋁致神經(jīng)細胞凋亡機制的體外實驗研究[D];山西醫(yī)科大學;2005年

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本文編號：1261227